刺玫果總皂苷的提取方法及抗氧化活性研究

劉金璐， 雷永平， 王曉林， 鐘方麗

(吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林 132022)

刺玫果是薔薇科薔薇屬植物山刺玫(RosadavuricaPall.)的成熟果實，具有抗衰老、耐缺氧、防治心腦血管疾病等作用，藥食同源且無毒副作用，具有很大的開發價值[1-3]。據報道，刺玫果含有的皂苷類物質具有降血糖、降血脂、抗病毒、抑制腫瘤和免疫調節等多種藥理作用[4-5]。微波協同酶提取法是近年來應用較廣泛的一種植物有效成分的提取新技術，具有高效、無毒、易控制等優點，而且得到的產物穩定，純度、活性較高[6-7]。本試驗對微波協同酶法提取刺玫果總皂苷的工藝條件進行了研究，并探索了刺玫果總皂苷提取物的體外抗氧化活性，以期為刺玫果的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺玫果，由吉林省延吉市林業局提供，經鑒定為薔薇科薔薇屬植物山刺玫的成熟果實；齊墩果酸對照品，成都曼思特生物科技有限公司；纖維素酶(生化試劑)，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；香草醛，天津市光復精細化工研究所；1，1- 二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)，上海如吉生物科技有限公司；鄰二氮菲，天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇、無水乙醇、高氯酸、冰乙酸、石油醚(60～90 ℃)、硫酸亞鐵等均為分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1950型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；KQ-250DE型數控超聲波清洗器，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；FA3204B型電子天平，上海天美天平儀器有限公司；W5-100SP型恒溫水浴鍋，上海申生科技有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；MAS-II型微波萃取儀，上海新儀化學科技有限公司；SHZ-D型循環水真空泵，河南省鞏義市英峪儀器一廠；DZ-2BCII 型真空干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制 精確稱取在105 ℃干燥4 h至恒重的齊墩果酸對照品0.19 mg，置于10 mL的容量瓶中，加無水甲醇適量使其溶解，定容，配制成質量濃度為0.19 mg/mL的對照品儲備液，再取對照品儲備液10 mL置于50 mL容量瓶中，無水甲醇定容至刻度，即得質量濃度為38 μg/mL的對照品溶液。精確量取上述齊墩果酸對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，分別置于具塞試管中，80 ℃水浴揮干溶劑，分別加入7%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，于70 ℃加熱25 min，取出，冰浴15 min，再加入5 mL冰醋酸稀釋，室溫靜置15 min后，以不顯色的對照品溶液為空白，用分光光度法在548 nm處測定吸光度[8]。

1.3.2 刺玫果干浸膏中總皂苷的含量測定 精確稱取干燥的刺玫果干浸膏粉0.16 g，加入適量甲醇超聲處理2次，每次15 min，轉移至50 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。吸取供試品溶液0.2 mL，置于10 mL具塞試管中，按“1.3.1”節方法測定干浸膏中總皂苷的含量，計算提取量。

1.3.3 含量測定的方法學研究

1.3.3.1 檢測波長的確定 吸取對照品溶液和供試品溶液各0.2 mL，分別置于10 mL具塞試管中，參照“1.3.1”節方法操作，用分光光度法，在400～650 nm范圍內掃描。

1.3.3.2 方法學研究 精密度試驗：吸取對照品溶液 0.1 mL 置于10 mL具塞試管中，按“1.3.1”節方法在548 nm波長處連續5次測定其吸光度，計算其相對標準偏差(RSD)。重復性試驗：取同一批刺玫果干浸膏樣品5份，分別稱取0.16 g，按“1.3.1”節方法制備供試品溶液并測定其吸光度，計算其RSD[9]；穩定性試驗：吸取供試品溶液0.1 mL置于 10 mL 具塞試管中，分別在供試品溶液制備后的0、1、2、3、4、5 h，按“1.3.1”節方法測定其吸光度，考察供試品溶液的穩定性[10]。回收率試驗：精確稱取己知含量的刺玫果干浸膏5份，每份0.1 g，每份供試品中分別加入齊墩果酸對照品 4.0 mg，按“1.3.2”節方法制備供試品溶液并測定其吸光度，計算加樣回收率。

1.3.4 刺玫果總皂苷提取方法的選擇

1.3.4.1 回流提取法 稱取4 g刺玫果粗粉，放入到燒瓶中，加入60%乙醇，加熱回流提取2 h，過濾，濾液回收乙醇，水浴濃縮成稠膏，然后放入60 ℃的電熱鼓風干燥箱中干燥，制備刺玫果干浸膏，按“1.3.1”節方法測定干浸膏中總皂苷的含量，并計算提取量[11]。

1.3.4.2 微波提取法 稱取4 g刺玫果粗粉，放入到燒瓶中，加入60%乙醇，進行微波提取2 h，過濾，濾液按“1.3.4.1”節方法制備刺玫果干浸膏，按“1.3.1”節方法測定干浸膏中總皂苷的含量，并計算提取量[12]。

1.3.4.3 酶解提取法 稱取4 g刺玫果粗粉，放入到燒瓶中，加入60%乙醇與0.02 g纖維素酶，加熱提取2 h，過濾，濾液按“1.3.4.1”節方法制備刺玫果干浸膏，按“1.3.1”節方法測定干浸膏中總皂苷的含量，并計算提取量[13]。

1.3.4.4 微波協同酶提取法 稱取4 g刺玫果粗粉，放入到燒瓶中，加入60%乙醇與0.02 g纖維素酶，加熱回流提取 2 h，然后再進行微波輔助提取5 min，過濾，濾液按“1.3.4.1”節方法制備刺玫果干浸膏，按“1.3.1”節方法測定干浸膏中總皂苷的含量，并計算提取量[14]。

1.3.4.5 微波協同表面活性劑提取法 稱取4 g刺玫果粗粉，放入到燒瓶中，加入60%乙醇與0.02 g表面活性十二烷基硫酸鈉，加熱回流提取2 h，過濾，濾液按“1.3.4.1”節方法制備刺玫果干浸膏，按“1.3.1”節方法測定干浸膏中總皂苷的含量，并計算提取量[15]。

1.3.5 微波協同酶提取法的優化 稱取刺玫果粗粉適量，放入到燒瓶中，加入提取溶劑與纖維素酶適量，加熱提取至一定時間，然后再進行微波輔助提取，過濾，濾液回收乙醇，水浴濃縮成稠膏，然后放入60 ℃的電熱鼓風干燥箱中干燥制備刺玫果干浸膏，按“1.3.1”節方法測定干浸膏中總皂苷的含量，并計算提取量。以總皂苷的提取量為參考指標，分別考察料液比、乙醇體積分數、酶解溫度、酶解時間、微波提取溫度、微波提取時間、微波功率對提取效果的影響，并在單因素試驗的基礎上，對主要影響因素進行正交試驗[16]。

1.3.6 工藝驗證性試驗 稱取4 g刺玫果粗粉3份，分別放入到燒瓶中并加入55%乙醇溶液與纖維素酶適量，加熱提取2 h，再微波輔助提取8 min，過濾，濾液按“1.3.4.1”節方法制備刺玫果干浸膏，測定3組干浸膏中總皂苷的含量，并計算提取量，求出其平均值及RSD。

1.3.7 體外抗氧化性的考察

1.3.7.1 刺玫果總皂苷對DPPH·的清除能力 精確稱取DPPH·適量，配制成0.2 mmol/mL的無水乙醇溶液。將刺玫果總皂苷配制成質量濃度分別為0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mg/mL的無水乙醇溶液[17]。分別吸取不同質量濃度的供試品溶液2 mL于10 mL比色管中，分別加入上述DPPH·無水乙醇溶液2 mL，混勻，在室溫下避光反應30 min后，以50%乙醇作參比，在波長517 nm處測定吸光度為D樣品。用2 mL蒸餾水代替上述供試品溶液，測其吸光度為D空白。用2 mL無水乙醇代替上述DPPH·無水乙醇溶液，測其吸光度為D對照[18]。清除率按下式計算：

DPPH·清除率=[(D空白-D樣品+D對照)/D空白]×100%。

(1)

1.3.7.2 刺玫果總皂苷對·OH的清除能力 吸取 1.5 mmol/L 的鄰二氮菲無水乙醇溶液1 mL于10 mL比色管中，依次加入磷酸鹽緩沖液PBS(0.2 mol/L)2 mL和蒸餾水 1 mL、0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL，充分混勻，加入1 mL的0.1% H2O2，于37 ℃下恒溫反應60 min，于536 nm處測其吸光度(DP)。同前步，其中用1 mL蒸餾水代替0.1% H2O2，測得吸光度(Db)。用供試品溶液1 mL代替上述的 1 mL 蒸餾水，測得吸光度(Ds)[19]。清除率按下式計算：

·OH清除率=[(Ds-DP)/(Db-DP)]×100%。

(2)

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以吸光度為縱坐標，齊墩果酸的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸。回歸方程：D=0.137 2C+0.0337 4，r=0.999 5。結果表明，齊墩果酸在0.633 3～5.066 7 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.2 含量測定的方法學研究

2.2.1 檢測波長的選擇 試驗結果表明，齊墩果酸對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為548 nm，而且二者峰型相似，所以選擇548 nm為檢測波長。

2.2.2 方法學研究 試驗結果表明精密度試驗的RSD為 1.37%，表明儀器精密度良好；重復性試驗的RSD為1.72%，表明該方法重復性符合要求；由穩定性試驗結果可知，樣品溶液在1.5 h內吸光度基本穩定，之后隨時間的延長吸光度有下降趨勢，因此供試品溶液最好在1.5 h內測定完成。加樣回收率試驗結果表明，該方法的平均回收率為99.50%，RSD為 1.52%(表1)。

表1 回收率試驗測定結果

2.3 提取方法的選擇

試驗結果表明，回流提取法，微波提取法、酶解提取法、微波協同酶提取法、微波協同表面活性劑提取法對刺玫果總皂苷的提取量分別為12.89、11.37、11.92、18.56、18.41 mg/g，其中微波協同酶提取法的提取量最高，所以選擇該方法作為刺玫果總皂苷的提取方法，進行深入研究。

2.4 微波協同酶提取法的優化

2.4.1 單因素試驗

2.4.1.1 料液比對提取量的影響 在提取體系中加入4 g刺玫果粗粉和0.02 g的纖維素酶，酶解水浴溫度為50 ℃，酶解時間為2 h，乙醇體積分數為60%，微波時間為5 min，微波功率為500 W，微波溫度50 ℃。分別以料液比(g ∶mL)1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40按“1.3.4.5”節方法進行提取。結果發現，刺玫果總皂苷的提取量在料液比為1 g ∶25 mL時達到較高水平，之后隨著料液比的增大呈現出逐漸下降的趨勢(圖1)。為了進一步考察料液比對提取量的影響，選擇料液比分別為1 ∶24、1 ∶28、1 ∶32、1 ∶36(g ∶mL)進行正交試驗。

2.4.1.2 酶解時間對提取量的影響 設定酶解時間分別為1、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4 h，其他按“2.4.1.1”節方法進行。結果發現，酶解2 h時刺玫果總皂苷的提取量達到最高，繼續延長酶解時間，提取量反而略有下降的趨勢(圖2)。為了進一步考察酶解時間對提取量的影響，選擇酶解時間為1.6、1.8、2.0、2.2 h進行正交試驗。

2.4.1.3 酶解溫度對提取量的影響 設定酶解水浴溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃，其他按“2.4.1.1”節方法進行。結果發現，酶解水浴溫度為70 ℃時刺玫果總皂苷的提取量達到最高，之后隨著酶解水浴溫度的升高而略有下降的趨勢(圖3)。為了進一步考察酶解水浴溫度對提取量的影響，選擇酶解水浴溫度為65、70、75、80 ℃進行正交試驗。

2.4.1.4 乙醇體積分數對提取量的影響 設定乙醇的體積分數為40%、50%、60%、70%、80%、90%，其他按“2.4.1.1”節方法進行。結果發現，乙醇體積分數為60%時刺玫果總皂苷的提取量達到最高，之后隨著乙醇體積分數的增加反而表現出略有下降的趨勢(圖4)。為了進一步考察乙醇體積分數對提取量的影響，選擇乙醇體積分數為55%、60%、65%、70%進行正交試驗。

2.4.1.5 微波溫度對提取量的影響 設定微波溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃，按方“2.4.1.1”節方法進行提取，結果發現，微波溫度70 ℃條件下刺玫果總皂苷的提取量達到最高水平，之后隨著溫度的上升提取量明顯降低(圖5)。為了進一步考察微波溫度對提取量的影響，選擇微波溫度為60、65、70、75 ℃進行正交試驗。

2.4.1.6 微波提取時間對提取量的影響 設定微波時間分別為2、4、6、8、10、12 min，其他按“2.4.1.1”節方法進行。結果發現，微波時間為8 min時刺玫果總皂苷的提取量達到最高，之后隨著微波時間的增加提取量略下降后趨于較平穩狀態(圖6)。因此，微波時間定為8 min。

2.4.1.7 微波功率對提取量的影響 設定微波功率分別為300、400、500、600、700 W，按“2.4.1.1”節方法進行提取。結果發現，微波功率600 W條件下刺玫果總皂苷的提取量最高，隨后隨著微波功率的增加提取量變化較小(圖7)。因此，微波功率定為600 W。

2.4.2 正交試驗

2.4.2.1 因素與水平的設定 根據單因素試驗結果，選擇料液比、酶解水浴溫度、酶解時間、微波溫度、微波功率5個因素，每個因素選擇4個水平(表2)。

2.4.2.3 正交試驗結果 取刺玫果適量，放入到燒瓶中，按正交試驗表進行試驗。結果發現，各因素對刺玫果總皂苷提取量的影響順序為酶解時間>酶解水浴溫度>料液比>乙醇

表2 正交試驗因素水平

體積分數>微波溫度。其最佳提取工藝條件為A4B3C2D2E1，即料液比為1 g ∶36 mL，酶解時間2 h，酶解水浴溫度70 ℃，乙醇體積分數為55%，微波溫度60 ℃，微波功率 600 W，微波時間為8 min(表3)。

表3 正交試驗結果分析

2.4.3 工藝驗證性試驗 為了考察上述最佳工藝的穩定性，按照正交試驗得到的最佳提取工藝條件提取3次，刺玫果總皂苷提取量分別為31.33、31.44、31.65 mg/g，平均值為 31.47 mg/g，RSD值為0.53%，表明該提取工藝具有良好穩定性。

2.5 體外抗氧化活性試驗

2.5.1 刺玫果總皂苷對DPPH·的清除能力 按“1.3.3.1”節方法進行試驗，研發發現，當刺玫果總皂苷的質量濃度較低時，隨著質量濃度的升高，其對DPPH·的清除率迅速上升，當總皂苷的質量濃度為3 mg/mL時，DPPH·的清除率達到91.14%，繼續提高刺玫果總皂苷的質量濃度，DPPH·清除率變化較小(圖8)。試驗結果表明，刺玫果總皂苷對DPPH·具有較強的清除能力。

2.5.2 刺玫果總皂苷對·OH的清除能力 按“1.3.3.2”節方法進行試驗，結果發現，隨著總皂苷質量濃度的升高，·OH的清除率不斷增加，當總皂苷的質量濃度為4 mg/mL時，·OH 的清除率達到73.68%，繼續提高刺玫果總皂苷的質量濃度，·OH的清除率變化不明顯(圖9)。試驗結果表明，刺玫果總皂苷對·OH具有一定的清除能力。

3 結論

刺玫果是具有多種藥理活性的天然產物，具有廣泛的開發前景。本研究比較了多種提取方法對刺玫果總皂苷的提取量，并對刺玫果總皂苷的體外抗氧化活性及其含量測定方法進行了考察。試驗結果表明，微波協同酶提取法對刺玫果總皂苷的提取量最高，并采用單因素和正交試驗對微波協同酶提取法進行了優化，其最佳提取工藝條件為料液比為 1 g ∶36 mL、酶解時間2 h、酶解溫度70 ℃、乙醇體積分數為55%、微波溫度60 ℃、微波功率600 W、微波時間為8 min，在上述提取條件下刺玫果總皂苷的提取量可以達到 31.47 mg/g。刺玫果總皂苷含量測定的方法學研究結果表明，該測定方法操作簡便、線性關系良好，回收率、重現性符合要求，可用于刺玫果總皂苷的含量測定。體外抗氧化活性試驗結果表明，刺玫果總皂苷溶液對·OH、DPPH·均具有一定

的清除能力。