蛋白質修飾糞腸球菌的Ames試驗

丁麗軍， 奚照壽， 袁華根

(江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州 225300)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)又稱糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)，屬于D群鏈球菌，是人和動物腸道內主要菌群之一[1]。糞腸球菌能產生細菌素等抑菌物質，抑制大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌的生長，改善腸道微環境[2]；還能抑制腸道內產尿素酶細菌和腐敗菌的繁殖，減少腸道尿素酶和內毒素的含量，使血液中氨和內毒素的含量下降[3]。糞腸球菌作為一種益生菌，在醫學和食品工程領域得到廣泛應用[4-5]。糞腸球菌是我國農業部2013年《飼料添加劑品種目錄》中公布的飼料級微生物添加劑菌種之一。研究發現，飼糧中添加糞腸球菌具有提高動物生產性能、改善營養物質代謝和提高免疫功能等作用[6-9]。蛋白質修飾糞腸球菌是采用某種特殊蛋白對糞腸球菌進行修飾的產品，以期在給予此益生菌的同時能對免疫應答有所增強。本研究通過Ames試驗以評價其體外致突變性，可為該產品的安全性評價積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物、試驗動物及菌株 受試物為蛋白質修飾糞腸球菌粉，5×109CFU/g，批號20141206，由江蘇省某生物技術公司研制。

SD大鼠，體質量200 g左右，購自揚州大學比較醫學中心，動物生產許可證號：SCXK(蘇)2012-0004，使用許可證號：SYXK(蘇)2012-0029。飼喂經60Co照射飼料，(24±2) ℃，濕度(60±20)%，自由采食和飲水，飲水為符合城市飲用水標準的自來水。試驗前在試驗環境中適應3 d。

試驗菌株：鼠傷寒沙門氏菌突變株TA97、TA98、TA100和TA102，由江蘇省疾病控制中心提供，試驗前經菌株鑒定符合要求。

1.1.2 試劑及配制 陽性對照物：2-氨基芴，純度>99%，日本東京化成工業株式會社；敵克松，純度98.8%，美國DIMA 技術有限公司；疊氮鈉，純度大于98%，美國Amresco公司；多氯聯苯(Aroclor1254)，美國Crescent Chemical有限公司。疊氮鈉溶解在水中，其他陽性對照物均用二甲基亞砜作為溶劑配制成相應濃度溶液。

0.5 mmol/L組氨酸-0.5 mmol/L生物素溶液、20%葡萄糖溶液、0.05 mol/L葡萄糖-6-磷酸溶液、營養肉湯及營養肉湯瓊脂培養基、頂層及底層瓊脂培養基等，均按食品安全國家標準細菌回復突變試驗(GB 15193.4—2014)中規定配制。

大鼠肝S9的誘導和制備：采用多氯聯苯(Aroclor1254)作為誘導劑，多氯聯苯溶于玉米油中，濃度為200 mg/mL，按 500 mg/kg體質量腹腔注射SD大鼠，給予正常的飲食和飲水。誘導注射后5 d，脫頸椎處死。按GB 15193.4—2014方法制備S9及S9混合液。S9制成后經無菌檢查、蛋白含量測定、生物活性鑒定合格后，-80 ℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 增菌培養 將保存的TA97、TA98、TA100、TA102菌株接種于營養肉湯培養基內，37 ℃振蕩(100次/min)培養 10 h。該菌株培養物應1 mL不少于1×109～2×109活菌數。

1.2.2 平板摻入法Ames試驗 配制0.5～500.0 mg/mL受試物系列濃度水溶液。

取已融化并在45 ℃保溫的頂層培養基2.0 mL，依次加入受試物溶液0.1 mL(每皿分別含受試物0.05、0.50、5.00、50.00 mg)和試驗菌株增菌液0.1 mL(需活化時加10% S9混合液0.5 mL)，迅速混勻，倒在底層培養基上，平放固化，37 ℃ 培養48 h，計數每皿回變菌落數及每處理各皿回變菌落數的平均數。

除受試物各劑量組外，還同時設陰性對照(滅菌水)、二甲基亞砜溶劑對照和陽性對照。陽性誘變劑為：-S9混合液時TA97、TA98、TA102菌株陽性對照物為敵克松，50.0 μg/皿；TA100菌陽性對照物為疊氮鈉NaN3，1.5 μg/皿。+S9混合液時TA97、TA98、TA100及TA102菌均以2-氨基芴為對照，10.0 μg/皿。每處理6個平皿，平行試驗2次。

1.2.3 結果判定 若受試樣品的回復突變菌落數等于或大于陰性對照組2倍，且有劑量-反應關系；或某一劑量超過陰性對照組2倍以上，呈現可重復的并有統計學意義時，即可認為受試物為誘變陽性。

2 結果與分析

Ames試驗結果，由表1可知，陽性對照組引起鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102這4 株試驗菌株的回復突變菌落數明顯增加，并遠超過陰性對照組的2倍以上；而受試品0.05、0.5、5.0、50.0 mg/皿的各劑量組，在加或不加S9活化時，回變菌落數均未超過陰性對照組菌落數的2倍，亦無劑量-反應關系。因此，受試品的Ames試驗結果為陰性。

表1 蛋白質修飾糞腸球菌的Ames試驗

3 結論與討論

蛋白質修飾糞腸球菌的Ames試驗結果為陰性，表明該產品對鼠傷寒沙門氏菌突變試驗菌株無致突變作用。

根據農業部新飼料或飼料添加劑安全性評價指南，致突變試驗除了Ames試驗外，還必須進行小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗。在這3個試驗的基礎上，根據試驗結果評估是否還需進行其他如顯性致死試驗等致突變試驗。本研究中受試物蛋白質修飾糞腸球菌的Ames試驗結果雖為陰性，至少還需進行小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗，才可對其致突變作用進行基本評價。