2016—2017年江蘇地區彎曲菌流行現狀監測

顏 衛， 趙莎莎， 盧勁曄， 羊建平， 沈曉鵬， 蔣珊珊

(江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州 225300)

彎曲菌是一種重要的人獸共患病原菌，不僅可以引起動物腹瀉、牛羊流產、雛雞壞死性肝炎，它也是全球范圍內引起人胃腸道感染最常見的病原菌，可引起人類發熱、急性腸炎、格林巴利綜合征等，兒童、老人和免疫缺陷癥病人是彎曲菌感染的高危人群，嚴重時可引起死亡。該菌廣泛分布于自然界，是許多畜禽的寄生菌，可通過動物、食物、水等傳播并引起人類感染，肉類、蔬菜、水等均存在不同程度的彎曲菌污染，對該菌的流行現狀監測對于食品安全、公共衛生有重要意義。

1 材料與方法

1.1 培養基與試劑

布氏肉湯、Carry-Blair運送培養基，購自北京陸橋技術有限責任公司；CCDA購自OXOID公司，Buffer、dNTPs、Taq酶、低分子量DNA marker，購自大連寶生物工程公司；微氧產氣袋購自MGC公司；綿羊全血購自蘭州民海生物工程有限公司。抗生素混合液：多黏菌素B、甲氧芐氨嘧啶、利福平各 0.125 g，放線菌酮1.250 g，加入25 mL丙酮蒸餾水混合液(1 ∶1 比例混合)溶解過濾后備用。彎曲菌生長促進劑：硫酸亞鐵、焦亞硫酸鈉、丙酮酸各稱取1.563 g，加入25 mL蒸餾水充分溶解，過濾備用。布氏肉湯高壓滅菌，冷卻后分別加入抗生素混合液和彎曲菌生長促進劑搖勻備用(200 mL中加入 1 mL)。CCDA配制完高壓滅菌后，冷卻至50～60 ℃加入頭孢哌酮(32 mg/L)和兩性霉素B(10 mg/L)。

1.2 樣品來源

2016年6月至2017年5月陸續采集醫院腹瀉病人(包括門診部和住院部)糞便樣本、農貿市場和超市食品樣本、環境樣本、動物源肛拭樣本(包括規模化圈養雞、散養雞、市場雞、養殖場鴨群、養殖場鵝群)共868份進行彎曲菌的檢測。

1.3 彎曲菌的分離

肛拭樣品、腹瀉患者送檢的糞便樣品插入Carry-Blair運送培養基中于12 h內送實驗室檢測。食品、環境樣品采集后置于4 ℃冰盒送實驗室立即檢測。取肉類、蔬菜樣品1 g剪碎，污水樣品1 mL，Carry-Blair培養基中取出的棉拭加入9 mL布氏肉湯(含抗生素和生長促進劑)，厭氧培養罐(加入微需氧產氣袋后立即密封)42 ℃搖床培養24 h，菌液接種CCDA平板，42 ℃培養箱(含10% CO2)培養24～48 h，選取濕潤、灰白色，有金屬光澤菌落3～5個，溶于50 μL超純水，隔水煮沸20 min后取出置于冰上，8 000 r/min離心5 min，取上清進行PCR檢測。

1.4 彎曲菌的鑒定

參照何蕊等的方法[1]，選取彎曲菌屬16S rRNA基因、空腸彎曲菌mapA基因、結腸彎曲菌CeuE基因設計引物。PCR體系中各成分的量為：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 3 pmol，16S rRNA的引物分別為20 pmol，mapA引物、CeuE引物各為 37.5 pmol，模板溶液2 μL，Taq酶0.2 μL。PCR反應程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。

空腸彎曲菌標準菌株經多重PCR擴增，在857、589 bp處分別出現屬特異性條帶和種特異性條帶；結腸彎曲菌經PCR擴增，在857、462 bp處分別出現屬特異性條帶和種特異性條帶。

2 結果與分析

2.1 人源樣本彎曲菌的監測結果

本試驗采集的183份腹瀉患者糞便樣本中有10份檢測出空腸彎曲菌，陽性率5.46%，有1份檢測出結腸彎曲菌，陽性率0.55%。147份5歲及以下嬰幼兒樣品中有10份樣品檢測出彎曲菌陽性，陽性率6.80%，其中9份樣品為空腸彎曲菌陽性，陽性率6.12%，1份樣品為結腸彎曲菌陽性，陽性率0.68%；36份6歲及以上腹瀉患者樣品中檢測出1份空腸彎曲菌陽性，陽性率2.78%(表1)。6—8月份的68份樣品中，檢測出6份彎曲菌陽性，陽性率8.82%，其中5份空腸彎曲菌陽性，1份結腸彎曲菌陽性，陽性率分別為7.35%、1.47%，9—11月份采集的56份腹瀉患者樣品中有4份檢測出空腸彎曲菌，陽性率7.14%，12月至第2年2月份的31份患者樣品中檢測到1份空腸彎曲菌陽性，陽性率3.23%，3—5月份的樣品未檢測到彎曲菌(表2)。來源于醫院門診的132份樣品中，彎曲菌陽性率7.58%，其中空腸彎曲菌陽性樣品9份，陽性率6.82%，結腸彎曲菌陽性樣品1份，陽性率0.76%，來源于醫院住院部的51份樣品中，僅1份檢測出空腸彎曲菌，陽性率1.96%(表3)。

表1 不同年齡人源樣品彎曲菌監測結果

表2 不同時期人源樣品彎曲菌監測結果

表3 不同采樣地點人源樣品彎曲菌監測結果

2.2 動物源樣本彎曲菌的監測結果

采集養殖場鴨群樣本59份，檢測出空腸彎曲菌陽性2份，陽性率3.39%，未檢測到結腸彎曲菌。采集養殖場鵝群樣本56份，檢測出空腸彎曲菌陽性7份，陽性率12.50%，未檢測到結腸彎曲菌。224份雞群樣品中，檢測出彎曲菌陽性樣品33份，陽性率14.73%，其中空腸彎曲菌陽性32份，結腸彎曲菌陽性1份，陽性率分別為14.29%、0.45%。不同來源的樣本彎曲菌感染率差異顯著。散養雞樣品空腸彎曲菌陽性率為6.25%，規模化圈養條件下的雞群樣品空腸、結腸彎曲菌陽性率分別為14.56%、0.97%，分離自農貿市場的雞源樣品空腸彎曲菌陽性率達22.81%(表4)。不同時期雞源樣品的監測結果，污染率最高的是6—8月，達21.98%(表5)。

表4 不同采樣點雞源樣品彎曲菌監測結果

表5 不同時期雞源樣品彎曲菌監測結果

2.3 食源樣本彎曲菌的監測結果

共采集市場食物、污水及超市冷凍雞肉346份，彎曲菌陽性率4.91%，監測結果見表6，共檢測到13份空腸彎曲菌陽性，陽性率3.76%，其中污染率最高的為市場鮮雞肉樣品，達到10.98%，豬肉和蔬菜樣品未檢測到陽性。346份食源樣品檢出結腸彎曲菌陽性4份，陽性率1.16%，冷凍雞肉未檢測到陽性。

表6 食源樣品彎曲菌監測結果

3 討論

彎曲菌是一種重要的食源性人獸共患病原菌，在自然界分布廣泛，寄生在多種動物如禽類、牛羊、寵物犬體內[2]。該菌已經成為最重要的腹瀉病原菌之一，尤其引起嬰幼兒腹瀉[3]。來源于醫院腹瀉患者的人源樣本共采集了183份，彎曲菌陽性樣品11份，陽性率6.01%，其中空腸彎曲菌陽性10份，陽性率5.46%，結腸彎曲菌陽性1份，陽性率0.55%。人源樣本中有147份為5歲及以下嬰幼兒患者樣品，彎曲菌的感染率最高，達到6.80%，其中空腸、結腸彎曲菌的陽性率分別為6.12%、0.68%，而6歲及以上患者的36份樣品感染率僅為2.78%，空腸、結腸彎曲菌的陽性率分別為2.78%和0.00%，這就提示了5歲及以下兒童是彎曲菌的主要感染者或者是帶菌者，5歲及以下兒童可能是彎曲菌的宿主，在彎曲菌病流行過程中充當傳染源的角色。不同時期人源樣本彎曲菌的監測結果提示，夏季(6—8月)、秋季(9—11月)彎曲菌的感染率顯著高于其他時期，達到高峰。不同來源的人源樣本統計結果顯示，醫院門診部的感染率顯著高于住院部的感染率，這可能是因為門診部病例尚未使用抗生素治療，住院部病例在收集樣品前已經使用相關抗生素。

分子流行病學研究表明，人類彎曲菌主要來源于家禽，尤其是雞群。不同時期雞源樣品彎曲菌監測結果顯示出了季節性，夏季是高峰期，季節性模式表明氣候因素對動物群體中彎曲菌的流行起著直接或間接的作用。溫度在13～20 ℃時雞群中彎曲菌感染率迅速增加，隨著溫度的進一步升高，感染率會在較高水平上有較小的增加，因此春季后雞群中彎曲菌的感染率增加顯著，本試驗的監測結果也提示雞群中夏季彎曲菌的陽性率顯著高于秋季。此外，世界范圍內彎曲菌病的發病率同樣具有很強的季節性，尤其是北歐國家。

食品禽肉中的彎曲菌主要來源于雞群，減少養殖環節彎曲菌的感染率是控制禽肉產品中彎曲菌的重要前提，雞群中彎曲菌的來源及影響菌體定殖的因素主要包括其他動物(家畜、蒼蠅、寵物等)、飼養人員、環境、設備、飲用水等。牛被認為是雞群彎曲菌的可能來源。彎曲菌在牛和肉雞之間存在間歇性的雙向傳播[4]。蒼蠅可能是雞群中彎曲菌引入的載體，感染有彎曲菌的蒼蠅在夏季通過通風進入雞舍，有研究證明在雞舍通風入口處使用滅蠅設備可以避免夏季彎曲菌感染率高峰期的出現[5]。飼養人員及設備被認為是引起雞群彎曲菌傳播的危險因素，飼養員在工作過程中應該遵守生物安全程序，如洗手洗澡、不同雞舍不交叉使用靴子、浸泡鞋子、更換鞋子和外衣、雞舍保持整體的清潔等。此外，運輸包裝箱也需要定期浸泡消毒液徹底消毒。雞腸道內彎曲菌的大量存在會造成屠宰過程中的交叉污染，給食品安全造成巨大隱患，有必要在屠宰加工前對雞群進行檢測，陽性雞群和陰性雞群分開屠宰。

屠宰加工過程中，糞便清除、脫毛、內臟取出等環節可能導致糞粒對于食品的污染，這些環節是食品安全的關鍵控制點。有研究指出，使用特殊的真空裝置可減少內臟去除環節腸內容物泄露造成的交叉污染[6]。冷空氣預冷代替浸泡和旋轉預冷可以避免預冷產生的交叉污染。彎曲菌對溫度、氧氣、滲透壓等較為敏感，采取適當的殺菌措施可有效降低禽肉表面彎曲菌的污染水平，如在屠宰加工過程中使用消毒劑處理禽肉胴體，用消毒劑消毒冷藏車、屠宰洗滌池等，此外冷凍處理法也是一種實用且有效的方法，彎曲菌對低溫較為敏感，低于30 ℃便不再生長，低溫儲存、運輸是降低肉品表面彎曲菌數量的有效措施。

本試驗采集的346份食源樣本，空腸彎曲菌、結腸彎曲菌的陽性率分別為3.76%、1.16%。空腸彎曲菌對食品和環境的污染高于結腸彎曲菌，說明食品和環境中彎曲菌的污染以空腸彎曲菌為主。超市冷凍雞肉彎曲菌2.38%的污染率低于市場雞肉12.20%的污染率，主要是由于彎曲菌在冷凍條件下生存能力急劇下降。市場生雞肉樣品中空腸彎曲菌的污染率顯著高于其他樣品，進一步提示雞肉是引起人類彎曲菌感染最主要的食源性傳染源，因此加強禽類及禽肉產品的食品安全管理是控制彎曲菌感染的重要環節。市場蔬菜和污水中彎曲菌的污染往往由動物性食品或動物糞便引起。豬肉樣品中結腸彎曲菌污染率高于空腸彎曲菌，提示豬肉產品中的污染以結腸彎曲菌為主的可能，當然這還需要更大樣本的數據支撐。

鑒于食品尤其是肉制品中彎曲菌的污染情況，在肉品消費階段可以采取一些措施控制污染，如生肉、熟肉分開存放，切割生肉時使用單獨的砧板等。另外，對食物進行熱處理也是一個最常用的避免污染的方法。烹飪食品時，食品內部溫度達到70 ℃并維持2 min以上，或內部溫度達到65 ℃維持10 min以上可以殺死包括彎曲菌在內的絕大多數病原菌。食物高壓處理、氣溶膠食品包裝技術也都能達到消毒的目的。