大蒜素對豬卵巢卵泡顆粒細胞凋亡的影響

丁 威， 湯 靜， 周燕芬， 邢 軍

(1.江蘇農林職業技術學院，江蘇句容 212400； 2.江蘇省農業科學院，江蘇南京 210014)

卵泡閉鎖是卵巢卵泡發育過程中一種正常的生理現象，該現象受多種因素影響和調控，在哺乳動物的一生中，最終只有少量卵泡發育為優勢卵泡并排卵，而90%以上的卵泡將發生閉鎖[1]。營養、環境或毒理方面的因素可能會造成卵泡的大量閉鎖，從而影響動物生產。在豬卵巢卵泡閉鎖過程中，顆粒細胞層逐漸脫落，未脫落的顆粒細胞比較飽滿，在高倍鏡下可清楚地見到凋亡的顆粒細胞核內形成的凋亡小體。雖然從形態特征上能夠觀測到卵泡閉鎖的變化，但有關豬卵泡閉鎖的機制及其挽救措施仍有待研究。

大蒜素為天然存在于百合科植物大蒜(AlliumsativumL.)鱗莖中的一種具有抗癌活性的成分，為三硫代烯丙醚類化合物，農業上用作殺蟲劑、殺菌劑[2-4]，也用于飼料生產、食品加工及藥品生產等方面。相關研究表明，大蒜素作為一種具有多種功能的飼料添加劑，既可以通過改善動物機體內各組織器官功能，強化胃腸道蠕動與消化酶的代謝，增加畜禽及魚類的采食，提高畜禽對飼料的消化利用，從而提高畜禽的生產性能[5]，又可以增強畜禽的免疫機能，從而預防多種疾病。但有關大蒜素對豬繁殖尤其是卵泡閉鎖的影響研究較少。

本試驗應用大蒜素對體外培養的豬卵巢顆粒細胞進行處理，通過檢測處理后顆粒細胞的凋亡情況及類固醇激素合成水平等，揭示大蒜素對豬卵巢卵泡顆粒細胞發育和功能的調控機理。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

從江蘇省南京市某生豬屠宰加工廠采集健康的豬卵巢作為試驗材料。將采集后的卵巢迅速放入裝有含青霉素、鏈霉素的37 ℃生理鹽水的保溫杯中，于2 h內運回實驗室。從某飼養場采集梅山豬的卵巢組織，放于4%多聚甲醛中固定 36～48 h，用于免疫組織化學染色試驗。

大蒜素購于Sigma公司；DMEM/F-12細胞培養液、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、青霉素、鏈霉素購于Life Technologies公司；胎牛血清購自Gibco公司；細胞增殖試劑盒、免疫熒光試劑盒、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG、HRP標記的驢抗羊IgG購自上海碧云天生物技術有限公司；雌二醇和孕酮放射免疫(RIA)檢測試劑盒購自北京北方生物技術研究所；蘇木素染料購自南京建成生物工程研究所；鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)試劑盒、3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 卵巢組織的免疫組織化學染色 參照丁威等的方法[6]對卵巢組織的免疫組織進行化學染色。脫蠟止水：二甲苯Ⅰ 7 min→二甲苯Ⅱ 7 min→100%乙醇Ⅰ 5 min→100%乙醇Ⅱ 5 min→90%乙醇5 min→70%乙醇2 min→蒸餾水5 min；滅活內源酶：用3%甲醇-H2O2處理15 min→蒸餾水5 min；抗原熱修復：檸檬酸三鈉(pH值=6.0)100 ℃ 10 min→PBS洗滌3次，每次3 min；加一抗：10%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，簡稱BSA)室溫封閉30 min→一抗加入后，須要在室溫條件下過夜，陰性對照可用1% BSA代替(cleaved-Caspase3抗體稀釋濃度為1 ∶200)PBS洗滌3次，每次3 min；SABC(strept avidin-biotin complex)反應：二抗加入后，須要在室溫條件下30 min→PBS洗滌3次，每次3 min→加SABC，室溫15 min→PBS洗滌3次，每次3 min；顯色：0.05% DAB+0.01% H2O2，顯色2～10 min→水沖洗5 min→蘇木素復染→水沖洗5 min；脫水透明：50%乙醇2 min→70%乙醇2 min→90%乙醇2 min→100%乙醇Ⅰ 2 min→100%乙醇Ⅱ 2 min→二甲苯Ⅰ 4 min→二甲苯Ⅱ 4 min；封片，用光學顯微鏡觀察并拍照，切片中棕褐色代表陽性表達。

1.2.2 細胞培養和處理 參照宋丹等的方法[7]對細胞進行培養和處理。在實驗室中將從屠宰場采集來的卵巢用37 ℃生理鹽水清洗3次，然后用10 mL注射器從卵巢表面選擇直徑為3～5 mm的卵泡抽取卵泡液，放入離心管靜置10～15 min，1 500 r/min離心2 min，PBS洗3次后，用血細胞計數板進行計數。將顆粒細胞放入含10%胎牛血清、20 ng/mL促卵泡素(FSH)、100 mg/L鏈霉素和100 IU/mL青霉素的基礎培養液6孔細胞培養板中，于5% CO2和37 ℃的培養箱中培養24 h，然后將顆粒細胞分成4組，第1組繼續用基礎培養液培養作為對照，第2組為添加H2O2(100 μmol/L)處理、第3組為添加大蒜素(50 μmol/mL)處理、第4組為添加大蒜素(50 μmol/mL)+H2O2(100 μmol/L)處理，其中大蒜素固體溶解于PBS并添加到培養液中，終濃度為50 μmol/L。培養24 h后，收集培養液用于類固醇激素水平測定。

1.2.3 類固醇激素測定 采用酶聯免疫法測定顆粒細胞培養液中的雌二醇(E2)和孕酮(P4)含量。E2和P4的靈敏度分別為<5 pg/mL和<0.2 ng/mL，批內變異系數小于10%，批間變異系數小于15%。

1.2.4 DAPI凋亡檢測 用6孔板接種傳代豬顆粒細胞以制作細胞爬片并進行相應處理。細胞在蓋玻片上生長融合到90%左右時從孵箱中取出，用預溫37 ℃ PBS洗3次，每次10 min，4%甲醛室溫固定30 min，PBS洗3次，每次10 min，然后用0.2% Triton X-100透化30 min，加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育 10 min，PBS清洗3次，每次10 min，最后在激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 細胞增殖活性檢測 從對照、H2O2、大蒜素、大蒜素+H2O2等4組處理中分別取100 μL約2 000個顆粒細胞放入96孔板中，依據MTT試劑盒說明書，每孔加入10 μL MTT溶液，在培養箱內孵育4 h，然后每孔再加入100 μL Formanzan溶解液繼續孵育4 h，直到在普通光學顯微鏡下能夠觀測到Formazan全部溶解，然后早570 nm處的測定溶液吸光值。

1.3 數據分析

用Excel 2010對原始數據進行整理，然后用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，差異顯著性比較采用Turkey檢驗法，所有數據均用(平均值±標準差)表示，至少重復4次。

2 結果與分析

2.1 Cleaved Caspase3蛋白在豬卵巢卵泡中表達的定位

魏全偉研究表明，Caspase3在由顆粒細胞凋亡引起卵泡閉鎖的過程中的表達存在顯著升高現象。為了進一步研究Caspase3的激活(Cleaved Caspase3)在豬卵巢卵泡壁退化過程的作用，選取正在閉鎖的卵泡(即顆粒細胞正在凋亡和脫落的卵泡)進行研究。免疫組織化學染色結果表明，隨著卵泡的閉鎖，顆粒細胞凋亡并脫落在卵泡腔內，顆粒細胞凋亡伴隨著染色質的濃縮。顆粒細胞的凋亡伴隨著Caspase3的激活(圖1-B、圖1-E)，而在健康的卵泡中幾乎不存在Caspase3的激活(圖1-A、圖1-D)。

2.2 顆粒細胞培養液中E2和P4激素水平變化

由圖2可知，氧化應激組(過氧化氫處理)中的E2濃度顯著低于對照組、50 μmol/L大蒜素處理組及50 μmol/L大蒜素和過氧化氫共同處理組(P<0.05)；而氧化應激組P4濃度顯著高于對照組、50 μmol/L大蒜素處理組及50 μmol/L大蒜素和過氧化氫共同處理組(P<0.05)。表明大蒜素可以提高顆粒細胞在氧化應激狀態下雌二醇分泌能力，并抑制顆粒細胞黃體化。雌激素和孕激素可以作為檢測細胞狀態的指標，結果表明，大蒜素處理下細胞狀態相對更好。

2.3 豬卵巢顆粒細胞的凋亡情況

顆粒細胞培養24 h后，將制作好的細胞爬片進行DAPI染色，用激光共聚焦顯微鏡細胞凋亡情況。結果(圖3)表明，與對照組相比，氧化應激組大量細胞發生形態學變化，而大蒜素處理組有效緩解了上述變化。細胞凋亡的典型特征包括細胞皺縮、染色質固縮、染色質新月體形成、DNA片段化和凋亡小體形成等。

2.4 豬原代顆粒細胞的增殖情況

由圖4可知，與對照組相比，氧化應激組顆粒細胞增殖活性顯著降低，而添加大蒜素與H2O2協同處理以后能夠顯著增加細胞增殖活性。該結果與凋亡檢測結果相一致。

3 討論

目前普遍的學術觀點認為，卵泡閉鎖主要是由卵巢卵泡顆粒細胞凋亡引起的[8]。因此，顆粒細胞凋亡的潛在機制可能是研究卵泡閉鎖的重要突破點和關鍵點。目前有關大蒜素抑菌作用的研究較多，相關研究認為，大蒜素可激活單核細胞的分泌水平，促使溶菌酶大量釋放，溶菌酶能水解細菌細胞壁中的粘多糖，使致病菌細胞破裂死亡，進而增強機體的非特異性免疫功能[9]。然而，有關大蒜素在顆粒細胞凋亡方面的研究較少。

免疫組織化學染色試驗結果表明，卵泡閉鎖過程中顆粒細胞的凋亡激活了Caspase3；而前期研究認為，Caspase3能夠進一步解離PARP-1，而PARP-1的解離參與卵泡閉鎖過程[10]。本研究發現，大蒜素能夠作用于卵巢顆粒細胞，并緩解H2O2造成的顆粒細胞凋亡。

在卵泡發育過程中，顆粒細胞不斷增殖使得卵泡不斷生長，并最終排卵[11-13]。顆粒細胞是卵巢中合成和分泌雌激素、孕酮等激素的主要功能細胞。多種哺乳動物的卵巢生長和卵泡發育均與卵巢的雌激素、孕激素分泌水平相關[14-16]。本研究發現，大蒜素可以改善氧化應激狀態下卵巢顆粒細胞的內分泌功能，表明大蒜素可用于豬生產，以提高豬抗應激水平和調節卵巢發育。

本研究結果還表明，氧化應激狀態下，顆粒細胞的增殖受到抑制，而大蒜素能夠在一定程度上提高顆粒細胞的增殖活性。該結果進一步說明大蒜素對顆粒細胞內分泌功能具有改善作用，為豬繁殖的營養調控提供參考。此外，應用體外豬卵巢顆粒細胞氧化應激模型，本研究結果進一步說明大蒜素在抑制顆粒細胞凋亡過程中可能發揮著某種重要的作用，可為大蒜素在豬育種及生產過程提供有價值的參考依據。而相關作用機制仍有待進一步研究闡明。