黃連木莖段組培快繁體系的建立

馬媛春， 劉 慧， 薛曉輝， 程宗明

(1.江蘇省農業科學院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京 210014；2.南京農業大學園藝學院，江蘇南京 210095； 3.江蘇省海安市林果技術推廣站，江蘇海安 226600)

黃連木(PistaciachinensisBunge)，英文名為Chinese pistache，屬于漆樹科黃連木屬，別稱黃楝樹、黃連茶、楷樹、藥樹、藥瘤樹等，其樹干挺拔，樹形美觀，樹葉繁茂秀麗，可作為庭陰樹、行道樹及觀賞風景樹[1]。此外，黃連木也是一種優良的木材、藥用和油料樹種[2]。近年來，人們對黃連木的研究主要集中于黃連木作為能源樹種的經濟價值、作為彩色葉樹種擁有的景觀價值，以及作為藥用植物的社會價值。

常規的黃連木繁殖方法有籽播育苗、嫁接和扦插等，然而由于黃連木種子外被蠟質，屬于深根類型，直接播種發芽較為困難，需要對種子進行脫蠟處理，然后再進行低溫層積處理[3-6]。嫁接和扦插繁殖對于環境要求較高，繁殖率較低，已不能滿足消費者的需求。

目前，由于江蘇省東部沿海灘涂鹽堿濃度較高，極少有觀賞植物能夠正常生長，為了改變這一現狀，應加大力度引進具有抗鹽能力的景觀植物。本研究所試種的黃連木來自美國海濱弗吉尼亞州，具有一定的耐鹽能力。組織培養技術能夠克服常規繁殖方法繁殖系數低的缺點，從而降低培養成本，提高經濟效益，實現良種快繁并達到產業化發展的客觀需求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料為一年生黃連木實生苗(種子來自美國海濱弗吉尼亞州)。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的準備與培養 選取長勢優良且健壯的黃連木植株的當年生嫩枝，去除葉片，用流水沖洗2 h左右，剪成15～20 cm長的帶腋芽的莖段備用(圖1)。在超凈工作臺上對外植體進行滅菌處理，先將莖段剪成1～2 cm左右(帶1個腋芽)的若干小段，用70%乙醇溶液消毒30 s，其間不斷搖晃，之后用無菌水沖洗3次，然后用0.1%氯化汞溶液消毒 10 min，消毒后立即用無菌水沖洗5次，最后用無菌濾紙吸干材料表面的水分，準備好單芽莖段用于接種[7]。

1.2.2 黃連木腋芽的誘導培養 將已處理的無菌莖段斜插于腋芽誘導培養基上進行誘導培養。所選取的誘導培養基以MS、WPM為基本培養基，并添加不同濃度的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)，共組成6種培養基(表1)。將外植體接種到6種培養基上，每瓶2個，每種培養基接種20瓶。于黑暗環境下培養，以減少褐化現象，培養溫度為(25±2) ℃，培養3 d后置于光照條件下培養[8]。培養基中蔗糖濃度均為30 g/L，瓊脂濃度為5.6 g/L，pH值為5.8，光照時間為14 h/d，光照度為100 μmol/(m2·s)，培養濕度為70%～80%。觀察離體芽的誘導培養情況，20 d后進行統計調查。

調查統計所用的相關公式：萌發率=(萌發外植體數/接種外植體數)×100%；褐化率=(褐化莖段數/接種莖段數)×100%；分化率=[分化數/(接種數-褐化數-污染數)]×100%。

表1 6種培養基組成成分

1.2.3 叢生芽的繼代增殖培養 將在誘導培養基上已經誘導培養20 d后的嫩芽剪切成1 cm左右的帶芽莖段，進行叢生芽誘導。以MS、WPM及1/2 WPM為基本培養基，附加不同濃度的6-BA、NAA，每個處理接種20瓶，每瓶接種1個莖段，重復3次。培養30 d后對材料的增殖系數、苗高及組培苗的生長狀況進行觀察并作統計分析。以上培養基中蔗糖濃度為30 g/L，瓊脂濃度為5.6 g/L，pH值均為5.8，培養溫度為(25±2) ℃，光照時間為14 h/d，光照度為100 μmol/(m2·s)。

調查增殖系數、苗高、生長形態等，相關公式如下：增殖系數=調查時的芽數-接種芽數；苗高=調查時的苗高-接種時的苗高。

1.2.4 組培苗的生根培養 以繼代培養的組培苗為試驗材料，選取生長健壯的組培苗，將增殖生成的叢生芽分株，每個芽為1株苗，接種到生根培養基上。每個培養基接種20株，重復3次，50 d后開始調查統計每種培養基的生根苗數及平均生根數。培養基中蔗糖濃度為30 g/L，瓊脂濃度為 5.6 g/L，pH值為5.8，培養溫度為(25±2) ℃，光照時間為14 h/d，光照度為100 μmol/(m2·s)。

1.2.5 生根組培苗的馴化與移栽

1.2.5.1 馴化 將生根良好、根系健壯的組培苗瓶蓋擰松，放置在無菌環境下3 d后，每2 d加入微量無菌水，光照度設為100 μmol/(m2·s)，光照時間設為12 h/d。并且逐漸開蓋，第10天時徹底開蓋，并及時補充適當水分(無菌水)。

1.2.5.2 移栽 將未污染、長勢良好的馴化組培苗取出，用無菌水沖洗附著在根系上的培養基，勿傷及根部，接著修剪基部葉片，保留頂端長勢好的復葉3～5張，然后移栽至基質中，放入人工氣候培養箱內進行培養。所選基質為蛭石、草炭土、珍珠巖，其體積比為9 ∶3 ∶1，放入高壓蒸汽滅菌鍋內于 121 ℃ 滅菌30 min。人工氣候培養箱中的溫度為25 ℃，相對濕度為80%，光照度為100 μmol/(m2·s)，光照時間為 12 h/d。移栽7 d后進行相關數據的統計。

1.3 統計分析

采用Excel和SPSS軟件進行數據統計與分析。

2 結果與分析

2.1 離體芽的誘導培養結果

通過預試驗發現，采用MS、WPM、1/2 WPM為基本培養基時，未取得腋芽萌發效果。由此可以看出，基本培養基不適合用于黃連木的腋芽萌發試驗。在預試驗的基礎上，添加細胞分裂素類生長調節劑6-BA以及細胞生長素NAA和IBA。由表2可以明顯看出，在黃連木腋芽誘導時期，基本培養基為MS的3種培養基褐化率較高，萌發率極低，基本無叢生芽；當培養基為1/2 WPM+1.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+0.10 mg/L IBA時，叢生芽較多，葉色較嫩綠，節間較長，生長粗壯，分化率達到91.7%(圖2)。通過6種培養基的對比可知，影響黃連木腋芽誘導的因素主次順序為基本培養基>細胞分裂素>細胞生長素，因此可見，細胞分裂素類生長調節劑6-BA的濃度對分化率的影響較大，當6-BA濃度達到 1.5 mg/L 時，分化率最高，長勢最好。

表2 不同培養基對黃連木腋芽萌發的影響

2.2 叢生芽的繼代增殖培養結果

在黃連木繼代增殖培養前期，經過不間斷的反復試驗，發現在細胞分裂素與細胞生長素共同作用的情況下，叢生芽的增殖數較多，當細胞分裂素類生長調節劑6-BA的濃度達到3.5 mg/L時，增殖倍數最高。由表3可以看出，在黃連木繼代增殖培養時期，在3種培養基上培養30 d后，芽的增殖倍數和生長情況存在差異，在WPM+3.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養基上的叢生芽較少，節間短，畸形苗多，玻璃化嚴重；在1/2 WPM+3.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養基上的叢生芽密集，微型化，畸形苗較多，玻璃化嚴重(圖3)； 而在培養基MS+3.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA 培養基上的叢生芽較多，苗生長健壯，生長速度較快(圖4)。綜合這3種培養基的研究結果以及本試驗的前期研究可以看出，除了細胞分裂素類和生長素類生長調節劑的用量配比對黃連木繼代增殖比較重要以外，基本培養基的選用對于黃連木繼代增殖也極為重要。經過3次重復試驗篩選出的適宜黃連木繼代增殖培養的最佳培養基配方為MS+3.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

表3 不同培養基對黃連木繼代增殖的影響

2.3 組培苗的生根培養結果

在試驗前期，采用MS為基本培養基進行生根培養，未取得生根效果。隨后，以1/2 MS、WPM、1/2 WPM為基本培養基進行試驗，結果表明，以WPM為基本培養基時無生根效果，因此可以得出結論：降低培養基無機鹽濃度，有利于不定根的發生[9]。外源生長素對生根有一定的促進作用，但外當源生長素的濃度超過一定限度時，組培苗的生長又呈下降趨勢。當以1/2 MS為基本培養基時，單獨添加不同濃度的NAA誘導黃連木苗生根， 發現其生根效果不佳；當NAA濃度為0.02 mg/L時，生根率最高；而當NAA濃度在0.2 mg/L及以上時，基本無發根(表4)。

在以上試驗的基礎上，添加IBA與NAA組合作用，繼續篩選適合生根的培養基。由表5可以看出，IBA能夠較好地誘導生根，但是濃度大于1 mg/L時，效果下降；基本培養基為1/2 WPM時比1/2 MS的生根效果好。培養基為1/2 WPM+0.02 mg/L NAA+1 mg/L IBA時生根效果最佳(圖5)，培養基為1/2 WPM+0.02 mg/L NAA+2 mg/L IBA時，根系粗短，不適宜移栽(圖6)。

表4 不同濃度NAA對生根的影響

表5 不同培養基生根誘導的影響

2.4 組培苗的馴化與移栽

將黃連木生根組培苗在馴化10 d后移栽，然后于人工氣候培養箱中放置20 d，再過渡到自然環境下生長，苗木移栽成活率可達67%以上(圖7)。

3 結論與討論

黃連木組織培養難度較大，在初代階段的褐化率較高，燒苗現象嚴重；在繼代時期，組培苗玻璃化嚴重，易產生畸形苗，從而影響試驗的進行；在誘導生根階段，大部分根系呈黑色，且組培苗生長緩慢，總體生根率不高[10]。利用黃連木莖段進行組培快繁，篩選出的最佳腋芽誘導培養基為1/2 WPM+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA。在繼代增殖時期，MS+3.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養基的增殖效果最佳，生根效果以1/2 WPM+0.02 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA配方的培養基較好。

本試驗發現，基本培養基的選用對于黃連木初代腋芽誘導極為重要；細胞分裂素類生長調節劑與細胞生長素的配比是影響黃連木繼代增殖的重要因素；影響黃連木生根培養的因素很多，包括無機鹽濃度、是否添加細胞分裂素、不同細胞生長素的作用、多種細胞生長素的協調作用配比等[11-12]。

黃連木組培快繁體系的建立，大大縮短了繁殖周期，降低了生產成本，也能夠解決種子繁殖所帶來的觀賞形態不一的缺點。本試驗建立了可供海濱生長的黃連木從腋芽誘導、增殖、生根、煉苗到移栽的快繁體系，從而為黃連木工廠化生產提供了理論依據。