柳葉栒子組培快繁體系的建立

馬媛春， 張粉粉， 程宗明

(南京農業大學園藝學院，江蘇南京 210095)

柳葉栒子(Cotoneastersalicifolius)為栒子屬植物，多生于山地溝邊雜林中、海拔1 800～3 000 m處，一般分布于我國的湖北、湖南、四川、貴州等地[1]。柳葉栒子的葉片呈革質而油亮，果實紅而累累，不但可以作為一種優美的園林植物來應用，而且柳葉栒子是一味珍貴的中藥材，對于治療咳嗽、除風熱有很好的療效。我國對栒子屬植物的研究和開發利用起步較晚。過去柳葉栒子主要依靠播種繁殖，不僅繁殖速度慢，繁殖的量也很少，柳葉栒子并沒有發揮其應有的園林及藥用價值，關于柳葉栒子的研究更是少之又少，幾乎沒有。而如今，隨著組織培養[2]和細胞培養[3]等新技術的產生，使得柳葉栒子的大量擴繁有了可能，通過組織培養技術將可以在短時間內培育出大量柳葉栒子幼苗。除柳葉栒子外，我國還有57種栒子植物，約占全世界栒子植物數量的2/3，但是全國各地對于栒子引種栽培的報道很少[4-6]，關于組培快繁成功的案例更是少之又少。所以通過建立柳葉栒子組培快繁體系，對栒子屬植物的組培快繁體系的研究也有幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

以柳葉栒子的實生苗為試驗材料(種子來自加拿大的城市公園，于2016年3月份播種于南京農業大學生科樓7樓果樹生物學實驗室育苗室)，進行消毒滅菌后，接種培養。

1.2 方法

1.2.1 外植體滅菌 選取長勢較好的實生苗，剪切成4 cm左右的帶芽莖段作為試驗材料，放入容器中，在自來水下沖洗2 h，后移至超凈工作臺內，用70%乙醇浸泡外植體30 s后用無菌水沖洗3次，然后用濃度為4%的次氯酸鈉分別處理3、4、5、6 min，再用無菌濾紙吸干莖段表面的水分[7]，將其切成 1 cm 左右的帶芽莖段，最好可以保留1～2張小葉片，再接種[8]。每個處理接種20瓶，每瓶接種1個外植體，重復3次，30 d后統計成活率。

1.2.2 腋芽誘導培養 將無菌莖段接種到腋芽誘導培養基上，首先為了確定腋芽在哪種基本培養基上誘導的效果更好，選取MS、1/2MS、1/2WPM 3種基本培養基[9]，在3種基本培養基內添加濃度相同的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)[10]進行預試驗，20 d后發現，腋芽在MS培養基上誘導的效果最好，因此在初代培養時選擇MS作為基本培養基，另外發現，在培養基中加入抗菌物質1.2 mg/L PPM(plant preservative mixture，植物組培抗菌劑)可以大大降低污染率[11-12]。由于初代培養的目的是為了誘導新芽，因此加入的細胞分裂素的濃度應高一些，生長素的濃度應該低一些[13-14]，本試驗選取的細胞分裂素為6-BA，濃度為0.5～3.0 mg/L，生長素為NAA(即α-萘乙酸，在預試驗中，得出最適宜的NAA濃度為 0.02 mg/L)，共組成4種培養基：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+1.2 mg/L PPM、MS+0.8 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+1.2 mg/L PPM、MS+1.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+1.2 mg/L PPM、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+1.2 mg/L PPM。在每種培養基接種20瓶，每瓶接種1個外植體，先放置在暗環境[15-16]中培養1周，再移至光環境下培養，來減輕褐化現象[17-18]，重復3次，30 d后統計腋芽萌發率。

1.2.3 叢生芽增殖培養 將初代培養30 d的組培苗新生芽剪下，切成1 cm左右的帶芽莖段，保留1～2張小葉片，轉入繼代培養基進行增殖培養。首先經過預試驗，確定繼代培養的最佳基本培養基也是MS培養基，并且發現繼代培養時不適宜加入NAA、IBA，只適宜加入6-BA[19-21]，濃度為0.5～2.0 mg/L，共組成4種培養基：MS+0.5 mg/L 6-BA、MS+1.0 mg/L 6-BA、MS+1.5 mg/L 6-BA、MS+2.0 mg/L 6-BA，每種培養基接種20瓶，每瓶接種1個外植體，重復3次，30 d后統計增殖率。

1.2.4 壯苗培養 由于前面階段所獲得的柳葉栒子無菌苗都比較矮小，不適宜直接用于誘導生根，需要經過壯苗培養，使苗長得強壯一些再進行生根培養。

1.2.5 生根培養 這個階段主要是誘導組培苗生出不定根[22-23]。在壯苗培養的過程中發現，組培苗在1/2MS、F培養基內有生根現象，因此選擇F、1/2MS作為生根的基本培養基。另外在壯苗培養中還發現，生長素濃度過高的培養基中幾乎沒有生根現象[14]，因此在生根培養基中選擇加入低濃度的NAA，濃度為0～0.1 mg/L，IBA濃度為0～0.3 mg/L，共組成8種培養基：1/2MS+0.05 mg/L NAA、1/2MS+0.1 mg/L IBA、1/2MS+0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA、1/2MS+0.3 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA、F+0.05 mg/L NAA、F+0.1 mg/L IBA、F+0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA、F+0.3 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA。每種培養基接種20瓶，每瓶接種1個外植體，重復3次，30 d后統計生根率。

1.2.6 組培苗的馴化移栽

1.2.6.1 組培苗的馴化 將生根健壯的組培苗從培養室移出來，放入溫室內，共6種煉苗方式：閉瓶煉苗0 d，開瓶煉苗0 d；閉瓶煉苗0 d，開瓶煉苗7 d；閉瓶煉苗7 d，開瓶煉苗0 d；閉瓶煉苗4 d，開瓶煉苗3 d；閉瓶煉苗7 d，開瓶煉苗4 d；閉瓶煉苗7 d，開瓶煉苗7 d。每種方式處理20瓶，每瓶1個外植體，重復3次。為了防止在開瓶煉苗期間濕度降低造成小苗干枯，每天要定時用純凈水噴灑小苗1次。

1.2.6.2 組培苗的馴化 在經過一段時間的煉苗處理之后，將長勢依舊茁壯的小苗從瓶中移出來，在移出來的過程中要用鑷子慢慢地小心地夾取小苗，以免小苗受到破壞。然后再將小苗放在自來水下，將殘留的培養基物質沖洗干凈。另外還要剪去小苗多余的葉片，以降低小苗的蒸騰作用，沖洗干凈后把小苗移入蛭石、泥炭土、珍珠巖體積比=2 ∶1 ∶1的基質中，移栽之前應對基質進行滅菌，本試驗采用的方法是將基質放入高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌3 h，再冷卻1 d，待氣味散去之后再進行移栽。

2 結果與分析

2.1 外植體滅菌

污染率隨著消毒時間的增加而減少，但是褐化率卻幾乎隨著消毒時間的增加而升高，當用4%次氯酸鈉消毒5 min時，組培苗的成活率最高，因此先用濃度為70%的乙醇對外植體消毒30 s，再用濃度為4%的次氯酸鈉消毒5 min是最適宜的滅菌方式。

2.2 腋芽誘導

6-BA對腋芽誘導有很大的影響，結果見表1。從生長情況來看，經過30 d初代培養后，各培養基內的生長情況有很大區別，當6-BA濃度為2.0 mg/L時，叢生芽幾乎糾結成團，變畸形，顏色有些呈深褐色，詳見圖1。當6-BA濃度為1.5 mg/L時，叢生芽比較細弱，還有些玻璃化，顏色較淡。當 6-BA 濃度為0.8 mg/L時，叢生芽長勢較好，顏色正常，詳見圖2。從各培養基內叢生芽的數量來看，當6-BA濃度為 0.8 mg/L 時，叢生芽數量最多，平均有12.33個，誘導率也最高，為61.65%；不添加6-BA的MS培養基中一直都沒有產生叢生芽；而當6-BA濃度為2.0 mg/L時，叢生芽的數量平均只有3.33個，誘導率僅為16.65%。另外，各培養基內叢生芽的數量隨著時間的變化趨勢也不盡相同，最早產生叢生芽的培養基是MS+0.8 mg/L 6-BA，且叢生芽數量一直在增加，增加得也最快；最晚產生叢生芽的培養基是MS+2.0 mg/L 6-BA，叢生芽的數量基本保持不變。綜上可以得出，最適宜的腋芽誘導培養基是MS+0.8 mg/L 6-BA。

表1 不同濃度6-BA對腋芽誘導的影響

2.3 叢生芽增殖

經過30 d的繼代培養后發現，培養基中添加的6-BA濃度不同，叢生芽增殖的結果也不同，詳見表2。從叢生芽數量來看，隨著6-BA濃度的逐漸升高，叢生芽的數量也在一定范圍內逐漸增多，但當6-BA濃度過高時，即MS+2.0 mg/L 6-BA培養基中叢生芽的數量反而比培養基MS+1.5 mg/L 6-BA中的少很多。從組培苗的平均生長量來看，在MS+1.0 mg/L 6-BA培養基中，叢生芽長得最快也最健壯，詳見圖3；在培養基 MS+2.0 mg/L 6-BA上，叢生芽長得很慢，有畸形苗，長勢最差，詳見圖4。從整體上來看，最適宜的繼代增殖培養基是MS+1.0 mg/L 6-BA。另外，在繼代培養時還發現，繼代次數對叢生芽增殖有一定的影響，在對柳葉栒子組培苗進行了7次繼代后發現，叢生芽增殖能力最強的是第3、

4次繼代，增殖倍數分別為8.95、9.25，增殖能力最弱的是第7次繼代，增殖倍數僅為3.90，第4次繼代的增殖倍數比第7次的高1倍以上。前4次繼代叢生芽的增殖能力都很強，而在第5次繼代之后，增殖能力逐漸減弱。因此可以看出，繼代的次數不一定是越多越好，隨著繼代次數的增加，組培苗體內的激素也會慢慢積累，從而抑制組培苗增殖。因此在平時繼代時，要對定期繼代的組培苗更換培養基，或者及時進行再次初代培養。

表2 不同濃度6-BA對叢生芽增殖的影響

2.4 生根培養

由表3可以看出，IBA、NAA及基本培養基的類型都對組培苗的生根有影響。當基本培養基為F時，NAA對生根的影響大于IBA，當NAA濃度為0.05 mg/L時，根系長勢最好。當以1/2MS作為基本培養基時，IBA、NAA對生根的影響都很大。只考慮IBA的影響時，當IBA濃度為0.1 mg/L時，生根較早；只考慮NAA濃度的影響時，當NAA濃度為0.1 mg/L時，根系最粗壯。綜合3個因素來看，生根率較高、根的長勢較好的培養基組合是F+0.05 mg/L NAA。

表3 不同培養基組合對組培苗生根的影響

2.5 煉苗移栽

經過煉苗的5個試驗組的成活率都遠遠高于空白對照組第1組。在本研究的6種煉苗方式中，只閉瓶煉苗或只有開瓶煉苗的成活率都低于既有閉瓶煉苗過程又有開瓶煉苗過程處理方式的成活率，而其中成活率最高的是先閉瓶煉苗 7 d，再開瓶煉苗4 d處理，成活率為72.58%。由此可以得出以下結論：(1)組培苗在移栽前需要進行煉苗；(2)在煉苗時要注意對時間的控制；(3)煉苗需要開瓶與閉瓶相結合才能取得理想的效果；(4)對柳葉栒子組培苗比較適合的煉苗方式是先將其閉瓶煉苗7 d，再將其開瓶煉苗4 d。

在移栽時發現，當基質中只有泥炭土與只有泥炭土與蛭石時，基質的透氣性差，小苗根部容易被淹，成活率極低；當基質中只有蛭石與珍珠巖時，基質的透氣性雖好，但幾乎不保水，導致小苗逐漸干枯，缺水癥狀嚴重，成活率也不高；當基質中泥炭土、蛭石、珍珠巖三者都有時，成活率較高，詳見圖5，但是如果三者比例不當，小苗的長勢也不是很好。最后，篩選出最適宜柳葉栒子組培苗移栽的基質是蛭石、泥炭土、珍珠巖體積比為2 ∶1 ∶1。

3 結論與討論

在柳葉栒子腋芽誘導時期，適宜的培養基為MS+0.8 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+1.2 mg/L PPM；在叢生芽增殖時期，最適宜柳葉栒子繼代增殖的培養基是MS+1.0 mg/L 6-BA；在生根培養時，最適宜的生根培養基是F+0.05 mg/L NAA，最佳煉苗方式是先閉瓶煉苗7 d，再開瓶煉苗4 d；最適宜的移栽基質是蛭石、泥炭土、珍珠巖體積比=2 ∶1 ∶1，移栽成活率高達72%以上。在選擇外植體時，最初用的是柳葉栒子的一年生莖段，最后因為污染非常嚴重而失敗，后來改用柳葉栒子實生苗作為外植體，進行滅菌后成活率較高。植物的不同部位所含菌量不同，采集外植體時要加以仔細選擇。繼代次數對于柳葉栒子叢生芽增殖有影響，不同植物受繼代次數的影響也不同。東方百合在進行繼代培養時，繼代3次后小苗的分化能力逐漸變弱，長勢也逐漸變差[24]。本研究中，在進行生根之前先對組培苗進行壯苗培養，在這個過程中只加入植物激素NAA，除了植物激素外，還可以考慮加入一些其他天然添加物，如香蕉泥、番茄泥等天然添加物，以及活性炭和馬鈴薯泥、椰子汁等物質，這些天然添加物價格低廉而且便于獲取，效果會很明顯，在以后的壯苗培養時可以適量加入。

通過建立柳葉栒子組培快繁體系來繁殖柳葉栒子，生產周期短，僅為4個月，而且繁殖速度非常快，生產出來的苗特別多，性狀也一致，可以實現柳葉栒子的工廠化生產，使得柳葉栒子在不久的將來可以大規模應用于園林中，從而為中國的園林綠化增添一抹亮色。