紅細(xì)胞血型基因分型在精準(zhǔn)輸血醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

(Tongmao ZHAO)

(美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，USA)，20892)

1900年人類ABO血型的發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了免疫血液學(xué)(Immunohematology)，它成為現(xiàn)代輸血醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)之一。在20世紀(jì)前半期，免疫血液學(xué)主要采用免疫血清學(xué)、生物化學(xué)以及經(jīng)典遺傳學(xué)等方法，檢測紅細(xì)胞表面的血型抗原和抗體。 20世紀(jì)90年代，隨著分子生物學(xué)技術(shù)擴(kuò)展到整個生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，分子免疫血液學(xué) (Molecular Immunohematology) 應(yīng)運(yùn)而生，它主要研究血型抗原和基因多態(tài)性的分子基礎(chǔ)。21世紀(jì)初生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域進(jìn)入了后基因組時代，相應(yīng)產(chǎn)生了一門新的血型基因組學(xué) (Blood Group Genomics) 學(xué)科，并建立了以DNA為基礎(chǔ)的血型基因分型技術(shù)，它在精準(zhǔn)輸血醫(yī)學(xué)(precision transfusion medicine)中扮演著重要角色。本文主要論述了血型基因分型在實(shí)際應(yīng)用中的一些最新研究進(jìn)展。

1 紅細(xì)胞血型抗原和基因

截止2017年被國際輸血協(xié)會(ISBT)認(rèn)可的總數(shù)為346個，其中308個分屬36個血型系統(tǒng)，其余38個抗原尚未被歸類。幾乎所有具有臨床意義的血型系統(tǒng)的分子基礎(chǔ)已被闡明[1]。根據(jù)美國國家生物技術(shù)中心(NCBI)的血型基因突變數(shù)據(jù)庫(Blood Group antigen gene Mutation Database，BGMUT)統(tǒng)計(jì)，目前已經(jīng)檢測出45個血型基因，含有1 800多個等位基因[2]。已闡明的血型遺傳多態(tài)性產(chǎn)生機(jī)制包括單核苷酸取代(SNP)、基因缺失或插入、基因不等交換、剪接位點(diǎn)突變、基因重組和雜交基因等[3]。

2 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代的分子免疫血液學(xué)

精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的基本概念是考慮到個體差異后所實(shí)施的預(yù)防診斷和治療策略，2011年美國科學(xué)院即提出要走向精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)、建立生物醫(yī)學(xué)研究的知識網(wǎng)絡(luò)和新的疾病分類學(xué)。美國奧巴馬總統(tǒng)在2015年的國情咨文中呼吁以精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方法改善醫(yī)療服務(wù)。美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)現(xiàn)任院長COLLINS在“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)新舉措”一文中提出，輸血中的血液分型是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的首例應(yīng)用之一[4]。2015年9月10日在NIH舉辦了“2015年精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)紅細(xì)胞基因分型”研討會，討論了分子免疫血液學(xué)的進(jìn)展和如何改變對患者的護(hù)理，通過病例報告說明患者護(hù)理策略；回顧了分子分型基礎(chǔ)研究及其在臨床實(shí)踐中意義；探討了紅細(xì)胞基因分型防止同種免疫的策略以及紅細(xì)胞基因分型在精準(zhǔn)輸血醫(yī)學(xué)中的未來發(fā)展[5]。

目前分子免疫血液學(xué)檢測在全球變得越來越普遍，血型工作者都認(rèn)可任何單獨(dú)血型血清學(xué)方法都不能滿足臨床輸血的實(shí)際需要，唯有結(jié)合更個性化的基因檢測方法才能使患者受益。基因分型作為輔助技術(shù)有助提高紅細(xì)胞定型準(zhǔn)確性，而且可以檢測血清學(xué)方法無法鑒定的血型基因多態(tài)性。2015年美國血庫協(xié)會(AABB)分子免疫血液學(xué)圓桌會議討論了在血型檢測領(lǐng)域具有挑戰(zhàn)性和爭議性的一些議題，會議認(rèn)為雖然血清學(xué)仍然是在緊急情況下的唯一實(shí)用方法，但是分子檢測是解決復(fù)雜問題的黃金標(biāo)準(zhǔn)，包括血型抗原的疑似變異體、表型被最近輸血掩蓋、直接抗球蛋白試驗(yàn)陽性的樣品等。會議預(yù)期如果分子技術(shù)變得更簡便易行、檢測時間更快、費(fèi)用更低，那么將來某些血型系統(tǒng)的基因分型可能會替代血清學(xué)分型[6]。

在血型基因檢測技術(shù)興起的同時，美國AABB于2008年率先推出“紅細(xì)胞、血小板、中性粒細(xì)胞抗原分子檢測標(biāo)準(zhǔn)”，在2016年已經(jīng)更新到第3版[7]。此外，AABB還舉辦一系列研討會，為這日益成熟技術(shù)的應(yīng)用提供了深入探討的平臺，發(fā)揮監(jiān)管和倡導(dǎo)作用，為創(chuàng)新鋪平道路，并通過其教育措施和出版物來傳播尖端研究結(jié)果。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)生物制品評估和研究中心(CBER)，作為評估和驗(yàn)證機(jī)構(gòu)也開始為紅細(xì)胞基因分型制定相關(guān)法規(guī)，制備用于評估基因分型技術(shù)和試劑的DNA參考品[8]。參考品將包括AABB推薦的約90種血型基因型，捐贈者紅細(xì)胞將冷凍保存用于血清學(xué)分型，同時通過EB病毒轉(zhuǎn)化來建立淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞株，通過細(xì)胞培養(yǎng)制備的基因組DNA也將通過國際合作等形式得到確認(rèn)。由于血型分布與人種以及種族群體相關(guān)，中國也在建立適合本國人群的血型基因標(biāo)準(zhǔn)DNA配組[9]。

3 血型基因分型用于檢測患者血型

3.1 直接抗球蛋白試驗(yàn)陽性和紅細(xì)胞多凝集作用患者

患者紅細(xì)胞與IgG抗體結(jié)合，在直接抗球蛋白試驗(yàn)中呈陽性反應(yīng)。雖然采用諸如二磷酸氯喹或EDTA-甘氨酸(EGA)處理紅細(xì)胞的方法可以去除IgG，但并非總是成功的。具有多凝集作用紅細(xì)胞的血型鑒定，通常都會遇到麻煩，在這些情況下基因分型可以預(yù)測患者紅細(xì)胞表型。

3.2 最近輸血患者

對于最近輸血的患者，獲得準(zhǔn)確的表型有時是不可能完成的任務(wù)。嘗試將輸入的供者紅細(xì)胞與患者紅細(xì)胞分開通常不會成功，因此患者最可能的表型一般是通過最佳猜測方法得出。但是DNA分型可以用來準(zhǔn)確預(yù)測患者的表型，而且輸入的供體白細(xì)胞不影響分型結(jié)果。

3.3 鑒定ABO血型疑難樣品

這些樣品包括ABO血型正反定型結(jié)果矛盾，ABO不匹配的造血干細(xì)胞移植、大量輸注外來血液、冷自身抗體、急性骨髓性白血病以及免疫缺陷病導(dǎo)致ABO抗原性減弱等。所有這些定型疑難樣品，都可以通過基因分型解決。參加2015年AABB分子免疫血液學(xué)圓桌會議的34%(18/53)與會者表示曾利用基因分型幫助患者進(jìn)行ABO定型，通常可以解決或確認(rèn)血清學(xué)所懷疑的A或B抗原變異體問題[6]。

3.4 鑒別弱D抗原和RhD陰性

D抗原具有臨床意義，在基因水平上定義了許多D變異體。從臨床角度來看，特別重要的是區(qū)分弱D與部分D表型。部分D表型個體可以產(chǎn)生抗D同種抗體，而弱D表型個體不能。某些D抗原變異體的D抗原性非常弱，使用血清學(xué)方法難以確認(rèn)，容易被誤定型為RhD陰性。比如常見于亞洲人中的RhDEL型，常被誤定為RhD陰性，因此需要通過基因分型鑒別是否是RhD陰性。目前已經(jīng)有報告提出在臨床實(shí)踐中應(yīng)該對血清學(xué)弱D表型患者進(jìn)行RhD基因分型[10]。

3.5 選擇基因型匹配供者

雖然對于大多數(shù)接受輸血患者不需要基因型匹配的供者，但是對某些特定患者需要個體化處理。比如有1例鐮刀型細(xì)胞貧血病患者，RH基因分型顯示是Dce純合子表型，攜帶2個RHCE*ce48C等位基因。該等位基因編碼RHCE基因外顯子1區(qū)域第16位半胱氨酸，與Dce表型相關(guān)，由于缺乏檢測RHCE*ce48C表型的抗血清，患者只能接受隨機(jī)供者血液，從而導(dǎo)致產(chǎn)生抗e抗體和溶血。而如果使用基因分型，選擇RHCE*ce48C等位基因匹配血液輸注會取得良好的效果[11]。在血清學(xué)鑒定為Dce表型的中國人中，大約有1/3的個體攜帶有RHCE*ce48C等位基因，因此遇到輸血產(chǎn)生抗體和溶血的患者應(yīng)該考慮此等位基因是否匹配。

3.6 無效型鑒定

無效型個體比較少見，通常是在患者已經(jīng)產(chǎn)生抗體后才被發(fā)現(xiàn)，這些抗體一般對應(yīng)高頻率抗原。現(xiàn)在可以在輸血前對患者做無效型基因檢測，確認(rèn)患者是否是無效型，以避免輸血后產(chǎn)生抗體。

3.7 協(xié)助解決復(fù)雜的抗體檢測

由于多種原因可能使鑒定血型抗體變得復(fù)雜，如受檢血清含有同種抗體和自身抗體、涉及到一些高頻率或低頻率的抗體和弱反應(yīng)的抗體、配組紅細(xì)胞缺少相應(yīng)抗原的抗體。使用基因分型有助于鑒定抗體。

4 血型基因分型用于預(yù)測供者血型

4.1 大規(guī)模的獻(xiàn)血者血型基因分型

對于由于輸血、妊娠、組織器官移植等同種免疫作用產(chǎn)生血型抗體的患者，需要輸注相應(yīng)抗原陰性的血液。血液中心的任務(wù)之一是提供ABO和D以外的特定抗原陰性血液。如果使用標(biāo)準(zhǔn)抗血清篩查，不僅耗時且費(fèi)用昂貴，而且不一定能夠獲得所有的分型試劑。血液中心可以放棄血清學(xué)篩查，代之以預(yù)先對獻(xiàn)血者紅細(xì)胞基因進(jìn)行分型，并整合到血液供應(yīng)鏈中，以滿足臨床對抗原陰性血液的需求。FLEGEL等[12]報道了43 966例獻(xiàn)血者42個紅細(xì)胞抗原基因分型結(jié)果，獲得1 667 026個基因型數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)728 482個抗原陰性基因型。在5 672例患者中，有5 661例(99.8%)需要抗原陰性紅細(xì)胞制劑，其中5 339例(95%)找到抗原陰性血液。紅細(xì)胞基因分型有可能改變將來的供血方式。基因型數(shù)據(jù)易于在線查詢，可以減少或避免血清學(xué)篩查，為患者提供廉價安全的抗原陰性紅細(xì)胞制劑。

4.2 篩選無效型獻(xiàn)血者

攜帶無效等位基因的個體，不表現(xiàn)相應(yīng)血型抗原，接受血液輸注很容易產(chǎn)生血型抗體，為此需要使用罕見的無效型獻(xiàn)血者血液。篩選無效型獻(xiàn)血者需要大量標(biāo)準(zhǔn)抗血清，在缺少相應(yīng)抗血清的情況下，即可以使用DNA做基因分型[13]。

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