EB病毒對結核感染T細胞試驗檢測的影響

汪林嬌　劉子杰　趙瀅

[摘要]目的探討EB病毒感染對結核感染T細胞試驗的影響。方法選取2015年1～12月昆明醫科大學第一附屬醫院疑似結核感染的患者246例，采集外周血同時進行結核感染T細胞試驗和EB病毒核酸檢測，分析結核感染T細胞試驗的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比和陰性似然比。結果結核感染T細胞試驗的靈敏度為83.87%，特異性為93.49%，準確度為92.27%，陽性預測值為65%、陰性預測值為97.57%，陽性似然比為12.88，陰性似然比0.17，約登指數為0.77。EB病毒再激活與結核感染性T細胞斑點試驗間有顯著性差異（P=0.021<0.05）。結論結核感染T細胞試驗對結核感染的診斷特異性較高，具有較好的臨床應用性能，EB病毒再激活會影響結核感染T細胞試驗。

[關鍵詞]結核；結核感染T細胞試驗；EB病毒；γ干擾素

[中圖分類號]R446.6 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2017）17-168-04

我國是結核病高發國家之一，據2010年全國結核病流行病學估算，全國≥15歲人口中活動性肺結核患者高達499萬，盡管活動性肺結核的患病率有所下降，但由于人口數量增加，實際患肺結核的人數較2000年反而有所增加。據世界衛生組織報道，結核病診斷率僅為37%，結核病診斷率低的主要原因是很難找到病原學證據，即使在發達國家結核病的診斷也僅有50%具有細菌學證據支持。因此，尋求一個敏感度及特異度均較高的非病原學檢測方法具有重要的臨床意義。結核感染T細胞試驗（T-SPOT.TB）是（ELISPOT）檢測結核感染的新方法，該試驗是以結核桿菌特異性抗原刺激T細胞，如果患者感染過結核桿菌則會釋放γ干擾素，從而可以通過ELISPOT技術進行檢測。T-SPOT.TB試驗的檢測主要通過抗原刺激記憶性T細胞釋放γ干擾素，因此影響γ干擾素釋放的因素可能會對檢驗結果產生影響。研究發現EB病毒能抑制干擾素的生成，EB病毒的一種蛋白具有類似ILl0的功能，它能抑制IFN-γ的合成和CD8+細胞毒性T細胞反應，因此EB病毒感染可能會對結核感染T細胞試驗造成影響，本文擬分析結核感染T細胞試驗的臨床性能并評價EB病毒感染對此實驗檢測結果的影響。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2015年1～12月昆明醫科大學第一附屬醫院住院疑似結核患者267例，收集每位患者臨床資料以及既往結核病史、結核接觸史、以及其他疾病和治療史。根據肺結核診斷和治療指南，根據臨床資料確診結核患者31例，其中男性18例，女性13例，年齡中位數32.5歲。排除結核病人215例，其中男性131例，女性84例，年齡中位數37歲。EB病毒感染組，EB-DNA≥400拷貝/mL12例，其中9例確診結核。

1.2T-SPOT.TB檢測方法

采用T-SPOT.TB試劑盒（英國牛津），根據說明書進行操作。

1.3 EB-DNA定量檢測

熒光定量PCR儀購自美國ABI公司（ABI-7300），全血DNA基因提取試劑購自天隆科技公司，EB-DNA定量檢測試劑購自湖南圣湘科技有限公司。DNA提取和擴增均按廠家試劑說明書進行。

1.4 ELISA法檢測抗-EA IgG

用德國IBL公司的成套試劑盒，按說明書操作，測定的吸光度，抗-EA IgG的吸光度值>0.5為陽性。

1.5統計學處理

計算靈敏度、特異性、準確度、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比采用SPSS19.0統計軟件進行數據處理及統計學分析，計數資料采用x²檢驗，當觀察例數小于4例時采用Fisher精確概率計算，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1T-SPOT.TB試驗的臨床性能評價

結果表明T-SPOT.TB試驗的靈敏度為83.87%，特異性為93.49%，準確度為92.27%，陽性預測值為65%、陰性預測值為97.57%，陽性似然比為12.88，陰性似然比0.17，約登指數為0.77。見表1。

2.2EB病毒載量對T-SPOT.TB試驗的影響

EB病毒感染組和非感染組間T-SPOT檢測結果間無顯著影響（P=0.697）。見表2。以抗-EA為EB病毒再激活的標記，結果表明EB病毒再激活與T-SPOT檢測結果差異有統計學意義。見表3。

3討論

人體初次感染結核分枝桿菌后，外周血中的T細胞發生致敏轉化，形成記憶性T淋巴細巴細胞，當再次接觸結核分枝桿菌時，記憶性T淋巴細胞能夠迅速活化增殖，從而引起γ干擾素釋放。T-SPOT.TB法即是基于以上原理，以ESAT-6（Rv3875）和CFP-10（Rv3874）肽段庫作為刺激原，檢測外周血中具有促進γ干擾素釋放的T淋巴細胞，從而反映是否感染過結核分枝桿菌。國內學者研究發現T-SPOT.TB對肺結核診斷的敏感度為80%～90%，特異性大于90%，對于肺外結核診斷靈敏度可達83%～91.7%，特異度可達76.5%～85%。多項研究結果表明，T.SPOT.TB診斷結核病具有較高的敏感度和特異度。Pai等對免疫力正常的726例研究對象進行分析，結果表明T-SPOT.TB的綜合敏感性為90%本文研究結果表明T-SPOT.TB試驗的靈敏度為80.95%，特異性為93.49%，陽性似然比為12.4，陰性似然比0.2，約登指數為0.74，與之前研究報道的結果一致。陽性似然比是檢驗結果的真陽性率與假陽性率之比，說明試驗正確判斷陽性的可能性是錯誤判斷陽性可能性的倍數，比值越大，試驗結果陽性時為真陽性的概率越大。因此，本文所得結果表明該試驗具有較好的區分患者與非患者的能力。靈敏度和特異性是一對矛盾對立體，它與診斷閾值有關，而在臨床工作中最關注的是該檢驗結果的陽性或陰性的價值，是否能診斷或排除某疾病，因此陽性和陰性預測值顯得比較重要，據報道云南的結核發病率約為52/10萬，因此如果一個普通的患者得到陽性結果時，該方法的陽性預測值為0.07%，而陰性預測值可達99.999%，這說明對于普通人群該方法具有很高的排除價值，而診斷價值較小，而在醫院就診的患者，其結核的發病率顯著高于普通人群，本文的研究對象均具有結核病相應體征或影象學表現，該人群中結核患病率為15.7%，陽性預測值為69.8%，陰性預測值為98.7%，由此可見，當待檢人群的患者率升高時其陽性預測值可顯著升高，因此若將此方法與指南中診斷標準中的一條或幾條聯合應用，如典型的肺結核臨床癥狀和胸部x線表現、抗結核治療有效、肺外組織病理證實結核病變等則可顯著提高該方法的陽性預測值。此外，本文結果也顯示該方法具有較高的陰性預測值，采用此方法排外肺結核具有重要價值。

當前全球有1/3的人感染結核，每年新發病例約800萬，結核仍是全世界導致死亡人數最多的疾病。目前針對結核的病原學診斷主要依靠抗酸染色和分離培養，分離培養是臨床診斷結核感染的主要依據之一，但分離培養時間長，檢出率相對較低，不利于結核病的早期診斷與治療。基于PCR的擴增方法靈敏度和特異性較高，但因標本原因導致檢出率仍不理想，血清學結核抗體檢測操作相對方便、快速，可作為輔助診斷的方法，但缺乏特異性和敏感性。T-SPOT.TB試驗采用結核桿菌特異性抗原進行檢測，可避免卡介苗所引起的交叉反應，可較好解決疫苗接種所帶來的影響，該方法具有較高的敏感性和特異性。此外，該方法采用血液標本進行檢測，避免了標本采集的影響，有利于臨床操作與保證結果的一致性。

T-SPOT.TB試驗的最終檢測物為γ干擾素，因此影響γ干擾素釋放的因素可能會對檢驗結果產生影響。因此高載量的EB病毒可能會干擾IFN-γ的生成與釋放。而本文的結果表明以400拷貝/mL為cutoff值進行分析，EB病毒對T-SPOT.TB檢測無顯著影響。可能存在以下幾方面原因，首先，本文中研究對象偏少，可能對結果有影響，下一步工作中應擴大樣本量進行分析，其次EB病毒為人群感染率較高的病毒，以400拷貝/mL為閾值進行判斷，則只要感染過該病毒的患者均可能為陽性，而在潛伏狀態下可能對γ干擾素釋放沒有影響。為研究EB病毒是否在再激活狀態下對γ干擾素釋放產生影響，文獻報道抗-EA抗體可作為EB病毒再激活的標記。我們采用抗-EA抗體作為再激活的標志，結果表明抗-EA與結核感染性T細胞檢測結果間有顯著性的差異，因此結果表明EB病毒在再激活狀態下可能會對結核感染性T細胞實驗造成影響，但有文獻報道EB病毒主要是對CD8+的細胞干擾素生成產生影響，是否對記憶型T細胞干擾素的生成有影響尚需進一步研究，同時本研究研究病例相對較少，如果擴大樣本量可能會更能證實本實驗結果；此外，雖然我們發現抗EA陽性與陰性組與結核感染性T細胞實驗間存在顯著差異，但沒有直接證據表明此是因為EB病毒再激活而造成的，但是否更高的病毒載量對T-SPOT.TB試驗有影響有待擴大樣本量進行進一步的研究。

（收稿日期：2017-06-21）