益氣去喘湯微生物限度檢查方法驗證試驗

陳俊濤

[摘要]目的通過篩選合理的檢查方法，為益氣去喘湯提供正確的微生物限度檢查標準。方法以據《中國藥典》2015年版規定，分別采用常規法、平皿法、培養基稀釋法對樣品進行微生物限度試驗。結果平皿法.對大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率均能達到要求；培養基稀釋法（0.5mL/皿）對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率能達到要求；對大腸埃希菌、沙門菌的檢查方法可使用常規方法進行檢查。結論試驗中選擇的酵母菌、細菌、霉菌的計數方法，以及控制菌所選用的驗證方法適用于益氣去喘湯的微生物限度檢查，本試驗可達到檢測目的。

[關鍵詞]益氣去喘湯；微生物限度檢查；驗證試驗；制訂檢查標準

[中圖分類號]R286.0 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2017）17-43-05

益氣去喘湯是我院多年臨床經驗處方，主要由黃芪、黨參、枇杷葉、前胡、桔梗、杏仁等藥物組成的，具有益氣、宣肺、化痰、平喘等功效，治療肺氣虛引起的哮喘、咳嗽等癥狀，療效顯著，安全可靠，無明顯副作用。在制劑檢驗過程中，為保證微生物限度檢查的科學性和準確性，以及確保本試驗選擇的檢測方案適用于益氣去喘湯中霉菌、酵母菌、細菌計數的檢測，以及控制菌的檢定，該驗證方案采用《中國藥典》2015年版一部附錄XⅢc微生物限度檢查方法進行驗證試驗，結果報道如下。

1試驗材料

1.1試藥

益氣去喘湯由本院煎藥室負責供應。

1.2試驗所需的培養基

營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、改良馬丁培養基、營養肉湯培養基、改良馬丁瓊脂培養基等。上述所用的培養基均系北京三藥科技開發公司生產。

1.3本試驗所用菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]、白色念珠菌（Candida albicans）[cMCC（F）98001]、乙型副傷寒沙門菌（Salmonellaparatyphi B）[CMCC（B）50094]。枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、白包念珠菌、乙型副傷寒沙門菌均由中國醫學菌種保藏中心提供。

2試驗驗證步驟

2.1試驗所用菌液的配制

2.1.1吸取在35℃經過24h培養的枯草芽孢桿菌、金黃葡萄球菌、沙門菌、大腸埃希菌的肉湯培養物1mL，使用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍量進行稀釋，枯草芽孢桿菌至10^-5、金黃色葡萄球菌至10^-7、沙門菌至1@8，大腸埃希菌至10-7、大約50～100cfu/mL，以備試驗使用。

2.1.2吸取在26℃經過24h培養的白色念珠菌液體培養物1mL，使用0.9%氯化鈉無菌溶液10倍量進行稀釋到10^-5，大約50～100cfu/mL，以備試驗使用。

2.1.3吸取在26℃經過7d培養的黑曲霉的改良馬丁瓊脂斜面培養物，加5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%氯化鈉無菌溶液，洗脫掉孢子。再吸取出含孢子的混懸液，加0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%氯化鈉無菌溶液10倍量進行稀釋到104，大約50～100cfu/mL，以備試驗使用。

以上所使用的各株菌的培養物都是三代培養物。

2.2試驗所用菌液的測定

2.2.1吸取以上枯草芽孢桿菌10^-5、金黃葡萄球菌10^-7、沙門菌10^-8、大腸埃希菌10^-7級稀釋后的溶液的量分別為1mL，使用45℃營養瓊脂培養基20mL分別注皿，并分別進行平行測定此二皿，調溫至35%，靜止48h后計算菌落數，大約50～100cfu/mL。測定的結果見表1。

2.2.2分別吸取以上配制的含黑曲霉104的孢子混懸溶液1mL、白色念珠菌10^-5稀釋溶液1mL，再取45℃玫瑰紅鈉瓊脂培養基20mL分別進行注皿后，然后再分別平行測定此二皿，調溫至26%，靜止培養，每日觀察，計算菌落數，大約50～100cfu/mL。測定的結果見表1。

2.3試驗驗證霉菌、酵母茵、細菌的計數方

依據《中國藥典》2015年版一部（附錄XⅢC）微生物限度檢查法中計算菌落數的方法進行驗證測定。試驗所用供試溶液的配制：量取供試藥液10mL，緩緩加入氯化鈉一蛋白胨無菌緩沖溶液至100mL，調至pH7.0，用玻棒攪拌混合均勻，此為供試溶液備用。

2.3.1平皿法結果見表2～6。

2.3.1.1試驗組 分別吸取上述供試溶液，按每個皿為1mL的量加入供試溶液，再加入上述已配制好的試驗菌50～100cfu，隨即傾入瓊脂培養基，放在規定的溫度下靜止3～5d，每天按時觀察。

2.3.1.2菌液組 將相同體積的供試溶液換成氯化鈉-蛋白胨無菌緩沖溶液（pH7.0），以照試驗組的方法進行驗證檢測。

2.3.1.3試驗對照組 對照組的試驗方法除不加菌液外，其他均與試驗組相同。

2.3.1.4計算試驗組的加菌回收率 根據下述計算公式計算回收率。

試驗組的加菌回收率=（試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數）/菌液組的平均菌落數×100%。

2.3.2培養基稀釋法結果見表5～6。

2.3.2.1試驗組 分別吸取上述供試溶液，按每個皿為0.5、0.2mL的量注入平皿，再注入上面已配制好的試驗菌50-100cfu，隨即傾入瓊脂培養基，放在規定的溫度下靜止3～5d，每天按時觀察。

2.3.2.2菌液組 測定方法與平皿法的菌液組相同。

2.3.2.3供試品對照組 試驗方法僅不加菌液之外，其他均與試驗組相同。

2.3.2.4計算試驗組的加菌回收率 根據下述計算公式計算回收率。

試驗組的加菌回收率=（試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數）/菌液組的平均菌落數×100%。

2.4驗證控制菌的測定方法

2.4.1驗證大腸埃希菌的測定方法 根據常規法進行試驗，試驗數據如表7。

2.4.1.1試驗組 在膽鹽乳糖培養基中加入供試溶液，按每100mL膽鹽乳糖培養基中加入供試溶液10mL，再注入上面已配制好的大腸埃希菌50～100cfu，放在35℃溫度下靜止24h，根據相應控制菌的測定方法進行試驗。

2.4.1.2陰性試驗對照組 將相同體積的供試溶液換成氯化鈉一蛋白胨無菌緩沖溶液（pH7.0），試驗方法僅不加菌液之外，其他均與試驗組相同。

2.4.1.3陽性試驗對照組 將相同體積的供試溶液換成氯化鈉一蛋白胨無菌緩沖溶液（pH7.0），其他試驗方法均與試驗組相同。

2.4.1.4供試品組 在膽鹽乳糖培養基中加入供試溶液，按每100mL膽鹽乳糖培養基中加入供試溶液10mL，放在35℃溫度下靜止24h，根據相應控制菌的測定方法進行試驗。

2.4.2驗證沙門菌的測定方法 根據常規法進行試驗，試驗數據如表7。

2.4.2.1試驗組 在營養肉湯培養基中加入供試品，按每200mL營養肉湯培養基中加入供試品10g，使其混合均勻，再加入上面已配制好的沙門菌50～100cfu，放在35℃溫度下靜止24h，根據相應控制菌的測定方法進行試驗。

2.4.2.2陰性試驗對照組 吸取上述營養肉湯培養基200mL，放在35℃溫度下靜止培養24h，根據相應控制菌的測定方法進行試驗。

2.4.2.3陽性試驗對照組 在營養肉湯培養基中加入沙門菌，按每200mL營養肉湯培養基中加入沙門菌50～100cfu，使其混合均勻，放于35℃溫度下靜止24h，根據相應控制菌的測定方法進行試驗。

2.4.2.4供試品組 在營養肉湯培養基中加入供試品，按每200mL營養肉湯培養基中加入供試品10g，使其混合均勻，放于35℃溫度下靜止24h，根據相應控制菌的測定方法進行試驗。

3討論

3.1驗證方法可用

在驗證霉菌、細菌、酵母菌數的檢查方法試驗中，根據試驗表2～6中的數據可知，平皿法對白色念珠菌、大腸埃希菌、黑曲霉的回收率均大于70%，都達到《中國藥典》2015年版一部附錄XⅢc微生物限度的要求，對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均小于70%；采用培養基稀釋法（0.5mL/皿），對金黃色葡萄球菌的回收率能達到要求；采用培養基稀釋法（0.2mL/皿），對枯草芽孢桿菌的回收率能達到要求；在驗證沙門菌和大腸埃希菌的檢查方法試驗中，根據表7中的數據可知，陰性對照組和供試品組未檢出控制菌，而試驗組和陽性對照組均檢出控制菌，因此，對沙門菌和大腸埃希菌可采用常規法進行檢查。

3.2驗證結果可靠

從上述試驗結果可知，對益氣去喘湯進行微生物限度檢查時，可以用培養基稀釋法（0.2mL/皿）對細菌數進行測定，可以用平皿法對霉菌、酵母菌數進行測定，可以用常規法對沙門菌、大腸埃希菌進行檢查。

3.3驗證目的達到

根據上述結論，制訂出益氣去喘湯的微生物限度檢查標準，具體為：吸取該湯藥加氯化鈉一蛋白胨的無菌緩沖液（pH7.0）配制為1：10的供試液。細菌的計數使用培養基稀釋法（0.2mL/皿）進行檢查，霉菌和酵母菌的計數使用平皿法檢查，沙門菌、大腸埃希菌的檢查用常規法，結果應符合《中國藥典》2015年版一部附錄XⅢC微生物限度的規定。

（收稿日期：2017-06-01）