熒光原位雜交技術(shù)及其應(yīng)用

錢文丹 陳波利

（貴州大學(xué)，貴州 貴陽 55000）

1 熒光原位雜交技術(shù)原理

熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。其基本原理是如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性—退火—復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、地高辛，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析［1］。與其他雜交技術(shù)進(jìn)行綜合比較發(fā)現(xiàn)，熒光原位雜交技術(shù)（FISH）具有一些優(yōu)勢：循環(huán)周期短，穩(wěn)定性高，非常安全；分辨率高，為3～20 Mb；探針能較長時(shí)間保存；多色標(biāo)記，簡單直觀；在熒光顯微鏡下在同一切片上同時(shí)觀察幾種DNA探針的定位，直接得到其相對序列和位置，從而大大加速生物基因組和功能基因組定位的研究。

2 熒光原位雜交技術(shù)要點(diǎn)

FISH選用的標(biāo)本可以是分裂期細(xì)胞染色體，也可以是間期細(xì)胞。生物素、地高辛、Dinitrophenyl（DNP）、Aminoacetyl Fluorine（AAF）等均可用于探針標(biāo)記。近年來，大片段的DNA探針（100～400 kb）已被研制出來，由于控針較長，故可將熒光物質(zhì)直接標(biāo)記在核苷酸上，使雜交過程進(jìn)一步簡化，而且雜交信號更強(qiáng)。

熒光原位雜交可以通過CCD（電荷耦合器件）相機(jī)系統(tǒng)或激光共聚焦掃描成像系統(tǒng)將攝取的信號存儲在計(jì)算機(jī)中，經(jīng)過軟件特殊處理后顯示在屏幕上。使用數(shù)碼成像相機(jī)系統(tǒng)或CCD相機(jī)系統(tǒng)，灰度圖像被拍攝幾次并存儲在計(jì)算機(jī)中，接下來通過一些人造色，軟件系統(tǒng)接收獲得的示例圖像，經(jīng)過軟件的綜合處理，最后以多色圖像顯示出來。此外，在G-帶狀染色體被75酒精或甲醇褪色后，F(xiàn)ISH可以更清楚地識別易位。

FISH技術(shù)和RFLP（Restrict Fragment Lenth Polymorphysim）結(jié)合，可以更準(zhǔn)確地描述染色體長短臂的結(jié)構(gòu)變化以及染色體梳子或復(fù)制品的性質(zhì)。FISH和細(xì)胞免疫技術(shù)結(jié)合，可以同時(shí)用多種顏色反應(yīng)檢測不同的核苷酸鏈和蛋白質(zhì)［2］。在基因圖譜繪制中，F(xiàn)ISH和連鎖圖譜結(jié)合起來，可以準(zhǔn)確確定具有高多態(tài)性的基因位點(diǎn)。

3 熒光原位雜交技術(shù)的發(fā)展

熒光原位雜交技術(shù)起源于1969年，自1990年以來，F(xiàn)ISH在方法上形成了從一種顏色到多種顏色、從中期染色體FISH到粗線染色體FISH再到纖維-FISH的發(fā)展趨勢，靈敏度及分辨率有了大幅度提高。

3.1 多色熒光原位雜交

多色熒光原位雜交（M-FISH），“M”分別代表“Multicolor”“Multiplex”和“Multitar get”3 種類型。M-FISH 的最大特點(diǎn)是可以在單個(gè)FISH實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行多個(gè)繁瑣的FISH實(shí)驗(yàn)和多個(gè)不同基因的定位。以下5種方法是基于多色彩FISH基礎(chǔ)上開發(fā)的新技術(shù)：染色體描繪、比較基因組雜交、光譜染色體自動核型分析、交叉核素色帶分析及多彩色原位啟動標(biāo)記［3］。

3.2 DNA纖維熒光原位雜交技術(shù)（DNA fiber-FISH）

Wiegant等首先利用化學(xué)方法染色體進(jìn)行線性化，再以此線性化的染色體DNA作為載體進(jìn)行FISH，使FISH的分辨率顯著提高，就是最初的纖維-FISH。據(jù)一些文獻(xiàn)記載，逐漸改進(jìn)了DNA纖維舒展延伸的方法，使DNA纖維的伸展程度有了很大的變化。DNA纖維熒光原位雜交的關(guān)鍵在于如何制備具有高分辨率且高質(zhì)量的線性DNA纖維，能進(jìn)行定量分析。

3.3 組織微陣排列技術(shù)

微陣列可以在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中檢測一個(gè)細(xì)胞中數(shù)百個(gè)基因的表達(dá)（減少和增加）。組織微陣列由組織微陣列區(qū)域中的500～1 000個(gè)單個(gè)腫瘤組織與管狀活組織檢查組成。細(xì)胞的組織和cDNA微陣列技術(shù)的組合可以提供一種有力的體內(nèi)鑒定基因的方法，可以對一些疾病及瘤的分子變化進(jìn)行重要評估。

3.4 熒光免疫核型分析和間期細(xì)胞遺傳學(xué)（FICTION）

FICTION是一種將熒光免疫核型分析和原位雜交相結(jié)合的方法，可以同時(shí)顯示異種細(xì)胞群中單個(gè)腫瘤細(xì)胞的免疫表型和一定的基因變化。FICTION具有診斷快速且可以再現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)，適用于FISH分析前或后沒有所需以前細(xì)胞樣品的細(xì)胞學(xué)樣本。FICTION可用于分析血液腫瘤的系譜，更好地了解腫瘤病理組織。

4 熒光原位雜交技術(shù)的應(yīng)用

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，熒光原位雜交技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。例如，染色體結(jié)構(gòu)變異的檢測，可以較容易地檢測出缺失、附加或替換的染色體；可用于產(chǎn)前診斷，近年來此項(xiàng)技術(shù)已用于診斷唐氏綜合征、膀胱癌等［4-5］；可用于基因定位，即利用激光共聚焦和其他熒光透視法觀察基因的位置；還可以用于血液腫瘤檢測。也有很多文獻(xiàn)報(bào)道了熒光原位雜交與其他技術(shù)的聯(lián)用，如與免疫、量子點(diǎn)、微流控芯等技術(shù)聯(lián)用，提高了效率，縮短了周期。