(U)HPLC及LC/MS技術(shù)在棗果功能性成分分離分析中的應(yīng)用

田 晶 ，李存滿(mǎn) ，李巧玲

（1.河北科技大學(xué)，河北省分析測(cè)試研究中心，河北石家莊 050018；2.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018）

棗（Ziziphus jujubaMill.）為鼠李科棗屬的藥食同源植物，在我國(guó)具有悠久的種植歷史，主產(chǎn)于河北、河南、山東、陜西等諸多地區(qū)[1]。《本草綱目》記載：棗味甘、性溫，能補(bǔ)中益氣、養(yǎng)血生津。棗中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，不僅含有糖類(lèi)，還含有三萜酸類(lèi)、環(huán)核苷酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、蛋白質(zhì)、氨基酸類(lèi)、維生素類(lèi)等多種化學(xué)成分[2]，具有抗癌、降血壓、降低膽固醇、保肝護(hù)肝、預(yù)防骨質(zhì)疏松、預(yù)防心血管疾病、預(yù)防膽結(jié)石等多種功能[3]。

（超）高效液相色譜 [Ultra high performance liquid chromatography，(U)HPLC]及液質(zhì)聯(lián)用（Liquid chromatography/mass spectrumLC/MS）技術(shù)在復(fù)雜體系如食品、中藥材等的分離分析中應(yīng)用越來(lái)越廣泛，尤其是LC/MS技術(shù)，將色譜技術(shù)的高分離能力與質(zhì)譜技術(shù)的高靈敏和結(jié)構(gòu)解析能力有機(jī)結(jié)合起來(lái)，其強(qiáng)大的定性定量能力在復(fù)雜體系中的應(yīng)用越來(lái)越受到關(guān)注。

目前，對(duì)于棗的物質(zhì)基礎(chǔ)的研究還很欠缺，從棗的復(fù)雜體系中提取并分離分析其功效成分引起更多科研人員的關(guān)注。(U)HPLC及LC/MS技術(shù)在棗復(fù)雜體系的分離分析過(guò)程中起著重要的作用，本文主要對(duì)該技術(shù)在分離分析棗的功效成分研究方面的應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)要的綜述。

1 應(yīng)用(U)HPLC及LC/MS技術(shù)來(lái)提取棗果中的三萜酸類(lèi)

棗果中含有豐富的三萜酸類(lèi)化合物，其中研究最多的是齊墩果酸、熊果酸和白樺脂酸。研究表明，齊墩果酸不僅對(duì)肝臟具有保護(hù)作用，而且具有抑制艾滋病病毒的作用[4,5]。熊果酸對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，能抵抗誘癌、致癌物，并且具有較高的安全性[6]。白樺脂酸對(duì)腦瘤、神經(jīng)外胚層瘤、白血病等惡性腫瘤細(xì)胞有抑制作用[7]。

目前，提取三萜酸類(lèi)化合物的主要方法有熱回流、冷浸、超聲[8-10]等。也有些研究采用甲醇或乙醇等有機(jī)試劑通過(guò)超聲的方法來(lái)提取三萜酸[10-13]，提取過(guò)程中可以通過(guò)70～80℃加熱的方式，也可以加入纖維素酶來(lái)提高提取率[14]，然后用大孔樹(shù)脂方法進(jìn)行分離[15]，該法是一種比較簡(jiǎn)便、有效富集三萜酸的方法。

分析棗中三萜酸的方法多采取HPLC法。對(duì)新疆若羌灰棗不同等級(jí)樣品中齊墩果酸、熊果酸和白樺脂酸的含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其含量與品質(zhì)之間不存在明顯相關(guān)性。由于三萜酸呈弱酸性，通過(guò)HPLC法測(cè)定齊墩果酸、熊果酸和白樺脂酸時(shí)，可用磷酸鹽體系、磷酸、冰醋酸調(diào)整流動(dòng)相的酸堿性，選擇甲醇-水體系，梯度洗脫方式[10]，但該方法受流動(dòng)相影響較大，檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低。三萜酸類(lèi)物質(zhì)紫外吸收極弱，可以利用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定，得出的峰形對(duì)稱(chēng)，雜峰較少，且靈敏度高；但ELSD也有其缺點(diǎn)，容易因氣體體積流量過(guò)低導(dǎo)致尖峰信號(hào)或噪音信號(hào)[11]。不同的色譜柱，對(duì)物質(zhì)分離能力有一定的差別，苗利軍等[12]用4種色譜柱分離棗中三萜酸，比較得出C18型色譜柱優(yōu)于CN型，反相色譜優(yōu)于正相色譜，250mm長(zhǎng)的BDS C18色譜柱優(yōu)于200mm長(zhǎng)BDSC18色譜柱，即采用較長(zhǎng)色譜柱有利于提高三萜類(lèi)物質(zhì)分離效果。

HPLC法進(jìn)行含量測(cè)定存在基線不理想、僅僅通過(guò)保留時(shí)間來(lái)確定待測(cè)成分可能造成誤判的風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題；而利用LC/MS分析技術(shù)，不受基線的影響，可以很好地排除其他物質(zhì)干擾，大大提高對(duì)棗等復(fù)雜體系中待測(cè)成分的定性定量分析能力[13]。Guo等人[16]通過(guò)UHPLC-MS/MS法更加精確地定性分析出棗中含有多種三萜酸以及在不同時(shí)期三萜酸的含量不同，發(fā)現(xiàn)三萜酸作為棗的質(zhì)量指標(biāo)，在9月份收獲最為合適。關(guān)于近幾年 (U)HPLC及LC/MS技術(shù)分離棗中三萜類(lèi)物質(zhì)應(yīng)用見(jiàn)表1（見(jiàn)下頁(yè)）。

2 應(yīng)用(U)HPLC及LC/MS技術(shù)提取棗果中的環(huán)核苷酸類(lèi)

環(huán)核苷酸及其衍生物有10多種，其中有重要生物活性的主要為環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）。劉世軍報(bào)道，棗果中的cAMP和cGMP含量是所有已測(cè)動(dòng)植物材料中最高的，鮮重分別為100～500nmol/g和30～40nmol/g[1]。cAMP和cGMP已被公認(rèn)為兩種具有反向調(diào)節(jié)作用的第二信使物質(zhì)，共同參與多種生理生化過(guò)程的調(diào)節(jié)，并可用于基因轉(zhuǎn)錄，影響蛋白質(zhì)合成，棗中cAMP是棗果中最重要的生物活性物質(zhì)，不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝，還能降血糖、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等顯著作用[17,18]。簡(jiǎn)便快速地對(duì)棗中天然cAMP和cGMP的提取及檢測(cè)對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)棗產(chǎn)品、推動(dòng)醫(yī)療保健發(fā)展具有重要意義[19]。

目前多采用冷浸超聲、熱回流、索氏提取、有機(jī)溶劑提取等方法來(lái)提取環(huán)核苷酸類(lèi)物質(zhì)[20]，其中大多以水為提取溶劑[21,22]，這樣較有機(jī)溶劑提取更具安全和環(huán)保性能。分離方法采用最多的是大孔吸咐樹(shù)脂法，不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂其作用的機(jī)理不同，可以除去多種雜質(zhì)，達(dá)到分離純化的目的[18,23]。

傳統(tǒng)檢測(cè)環(huán)核苷酸方法有紙層析色譜、薄層色譜法、競(jìng)爭(zhēng)蛋白法以及酶聯(lián)免疫法等，這些方法存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度不高、重復(fù)性差、人為實(shí)驗(yàn)操作誤差大等問(wèn)題，而HPLC法較之更具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及精確度好的特點(diǎn)。用HPLC法測(cè)定壺瓶棗中的cAMP含量高于大龍棗中cAMP的含量[24]，蔣勵(lì)博[25]采用UPLC法測(cè)得了棗中cAMP實(shí)際提取量，與理論值相差不大。除了用常見(jiàn)的反相色譜法測(cè)定不同棗品種中cAMP的含量外[21]，還可以采用親水作用液相色譜（HILIC）法測(cè)定棗中環(huán)核苷酸含量，HILIC具有良好的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性[26]。

表1 （U）HPLC及LC/MS技術(shù)分離分析棗中三萜類(lèi)物質(zhì)應(yīng)用Table 1 The application of(U)HPLC and LC/MS technology in separation of three terpenoids in jujube

表2 （U）HPLC及LC/MS技術(shù)分離分析棗中核苷類(lèi)物質(zhì)應(yīng)用Table 2 The application of(U)HPLC and LC/MS technology in separation of nucleosides in jujube

關(guān)于近幾年 (U)HPLC及LC/MS技術(shù)分離棗中環(huán)核苷酸應(yīng)用見(jiàn)表2。LC/MS技術(shù)用來(lái)分析棗果中的復(fù)雜成分是十分有利的，趙恒強(qiáng)等[22]建立了親水作用液相色譜-電噴霧離子源-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（HILIC-ESI-QTOF/MS）定性、定量分析棗中cAMP的方法，該方法具有很好的分離度、靈敏度，可以實(shí)現(xiàn)不同棗中cAMP的準(zhǔn)確、快速定性和定量測(cè)定。Q-TOF-MS高分辨質(zhì)譜可以推斷出cAMP的分子式，對(duì)于化合物的結(jié)構(gòu)解析是非常有利的。

3 應(yīng)用(U)HPLC及LC/MS技術(shù)提取棗果中的黃酮類(lèi)

黃酮類(lèi)化合物是棗的主要化學(xué)成分之一，棗中總黃酮對(duì)油脂具有抗氧化作用，并且能清除羥自由基[27]；同時(shí)，黃酮類(lèi)化合物對(duì)血管有舒張作用，拮抗血小板活化因子[1]。隨著人們對(duì)黃酮類(lèi)化合物的深入研究，學(xué)者們還發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛以及調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等重要作用[28]。

目前，大棗中黃酮提取方法有超聲提取法、回流提取法等[29，30]，還可以通過(guò)加入乙酸乙酯進(jìn)行冰浴均質(zhì)后再提取[31]，考慮到綠色環(huán)保、安全技術(shù)方面，可以用環(huán)糊精作為提取劑提取黃酮類(lèi)化合物[32]，分離黃酮類(lèi)多用雙向紙層析、薄層層析及柱層析，還可運(yùn)用QuEChERS法達(dá)到快速分離純化的目的[33]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)黃酮化合物的提取分離研究很多，但對(duì)棗中黃酮的提取分離研究較少[34]。Zhao等[35]通過(guò)HPLC法同時(shí)測(cè)定了7種棗中根皮苷、兒茶素、沒(méi)食子酸、綠原酸和咖啡酸，并測(cè)得這些酚類(lèi)物質(zhì)的含量與抗氧化能力呈正相關(guān)。李喜悅[36]利用HPLC法同時(shí)檢測(cè)出14種不同棗葉中槲皮素-3-O-洋槐糖苷、蘆丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷5種黃酮的含量。

袁亞娜[37]將不同時(shí)間出峰的液相餾分收集起來(lái)再分別進(jìn)行質(zhì)譜分析，推測(cè)出棗中存在雙黃酮類(lèi)化合物。師仁麗等[29]采用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)-HPLC和LC/MS技術(shù)對(duì)金絲小棗中黃酮類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行分析和鑒別，并測(cè)得金絲小棗中含有楊梅素、蘆丁、槲皮素、異鼠李素4種黃酮類(lèi)物質(zhì)。LC/MS技術(shù)在黃酮類(lèi)分析中的應(yīng)用較棗中其它物質(zhì)應(yīng)用更為廣泛。關(guān)于近幾年(U)HPLC及LC/MS技術(shù)分離棗中黃酮類(lèi)物質(zhì)應(yīng)用見(jiàn)表3。

4 應(yīng)用(U)HPLC及LC/MS技術(shù)提取棗果中的糖類(lèi)

棗多糖是棗中重要的生物活性物質(zhì)，鮮棗的總糖含量大約為30%～40%，水溶性糖以D-葡萄糖為主。阿拉伯糖、核糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖等共同組成大棗中的低聚糖[1]。多糖類(lèi)被證明具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、補(bǔ)血養(yǎng)血、抗腫瘤作用等功能，且其對(duì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)病毒的繁殖也有一定的抑制作用[38，39]。

表3 (U)HPLC及LC/MS技術(shù)分離分析棗中黃酮類(lèi)物質(zhì)應(yīng)用Table 3 The application of(U)HPLC and LC/MS technology in separation of flavonoids from jujube

多糖種類(lèi)繁多，其提取方法也很多，如水提法、超聲法以及微波法[40-42]等。超聲波輔助提取法能夠縮短提取時(shí)間及提取溫度[39]，水提法可以得粗多糖，多糖中無(wú)機(jī)鹽主要采用層析法去除，活性炭、樹(shù)脂進(jìn)行脫色，凝膠色譜柱進(jìn)一步分離純化[43]。方法提取率不高，粗提物純度較低，成分復(fù)雜。目前國(guó)內(nèi)外測(cè)定多糖中單糖組分的色譜分離方法主要有氣相色譜法（GC）、HPLC法和薄層色譜法（TLC）等[40]，由于GC法[44]對(duì)食品中糖的測(cè)定需要衍生化反應(yīng)且操作復(fù)雜，誤差較大。而HPLC法[45]采用示差折光檢測(cè)器不需要衍生化，操作簡(jiǎn)便，所以近年來(lái)得到了快速發(fā)展。據(jù)報(bào)道，可以同時(shí)采用GC/MS和HPLC來(lái)實(shí)現(xiàn)大棗功能性糖分的單糖組成及平均分子質(zhì)量測(cè)定[40]。也可以用HPLC配備紫外檢測(cè)器（UV）法測(cè)定糖類(lèi)，但需要衍生化。王向紅等人[46]利用柱前衍生HPLC-UV法檢測(cè)出不同品種棗的水溶性多糖是由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、甘露糖6種單糖組成的，且單糖組成比例存在很大差異[46]。不同產(chǎn)地鮮棗中糖的組分和含量不同，研究發(fā)現(xiàn)鮮棗中單糖的組成主要為蔗糖，并且糖分含量表現(xiàn)為蔗糖＞果糖＞葡糖糖＞麥芽糖，由此可知產(chǎn)地對(duì)糖分含量有一定影響[45]，此研究與之前的研究[47]相比，前處理階段未用到固相萃取柱。目前，尚未見(jiàn)LC/MS技術(shù)在棗糖類(lèi)分析檢測(cè)中的報(bào)道。關(guān)于近幾年HPLC技術(shù)分析棗中糖類(lèi)物質(zhì)應(yīng)用見(jiàn)表4。

表4 HPLC技術(shù)分離分析棗中糖類(lèi)物質(zhì)應(yīng)用Table 4 The application of HPLC technology in the separation of saccharides in jujube

5 其它物質(zhì)的提取

棗中的有機(jī)酸不僅起到調(diào)解風(fēng)味作用，還增加了其營(yíng)養(yǎng)的功效[48]。提取有機(jī)酸的方法可以用水提取或者甲醇提取。HPLC法[49]測(cè)得棗果中6種有機(jī)酸含量由高到低依次為：蘋(píng)果酸＞檸檬酸＞酒石酸＞奎寧酸＞草酸＞富馬酸，本方法較固相萃取、毛細(xì)管電泳等傳統(tǒng)的有機(jī)酸測(cè)定方法靈敏度高，較GC/MS法方便快捷[50]。Bekir San等[51]利用HPLC法測(cè)得棗中含有兒茶素、咖啡酸、表兒茶酸、阿魏酸、蘆丁、對(duì)羥基苯甲酸和綠原酸，其中酚類(lèi)物質(zhì)主要是兒茶素（含量為2.46～3.74mg/100g）和蘆丁（含量是0.88～3.60mg/100g），同時(shí)利用GC/MS法檢測(cè)出油酸、亞油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸，得出棕櫚酸是主要的飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸含量為棗果總脂肪的68.54%～72.44%。棗在不同浸泡溫度條件下糖精鈉的含量不同[52]，該檢測(cè)對(duì)食品安全具有重要實(shí)際意義。

6 結(jié)論

(U)HPLC、LC/MS技術(shù)在棗等復(fù)雜體系的分離分析中的應(yīng)用很普遍，并且隨著新型的分離材料及功能材料的不斷推出、(U)HPLC及LC/MS技術(shù)的不斷提升，其應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣泛。棗中含有豐富的多糖、酚類(lèi)、環(huán)核苷酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被越來(lái)越多的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用棗新產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。

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