反應時間對DPPH?法、ABTS＋?法評價抗氧化性結果的影響

林戀竹，趙謀明

目的：大多數抗氧化活性評價方法主要基于兩種機制：氫質子轉移（HAT）和電子轉移（ET）。由于DPPH?法、ABTS＋?法操作簡單，常被用作為抗氧化活性評價方法。用這兩種方法進行抗氧化活性評價時，通常用固定反應時間下算得的 IC50值（自由基清除率為50%時所需試樣濃度）表征抗氧化劑的抗氧化活性強弱。DPPH?法、ABTS＋?法并非純粹基于ET機制，在反應過程中，也會伴隨HAT機制。因此，在不了解抗氧化劑與DPPH自由基、ABTS＋反應的動力學機制的情況下，就簡單將反應控制在某一時間下，并在相同條件下，與其它抗氧化劑的IC50值比較，可能對抗氧化劑的抗氧化活性帶來錯誤的判斷。本文研究了食品工業中常用的12種抗氧化劑與DPPH自由基、ABTS＋的反應動力學，為DPPH?法、ABTS＋?法評價抗氧化劑的抗氧化活性提供可參考的信息。方法：以食品工業常用的6種合成抗氧化劑（BHA，BHT，TBHQ，抗壞血酸棕櫚酸酯，D-異抗壞血酸鈉，和抗壞血酸）以及6種天然抗氧化劑（VE油，茶多酚，竹葉提取物，迷迭香提取物，單寧酸，和蘆丁）為研究對象，采用紫外-可見分光光度法，分別研究這12種抗氧化劑與DPPH自由基、ABTS＋的反應動力學。根據 12種抗氧化劑對 DPPH自由基的清除率計算得到的 IC50值，將抗氧化劑分為兩組：（1）單寧酸、茶多酚、TBHQ、BHA、抗壞血酸、蘆丁、BHT、D-異抗壞血酸鈉；（2）抗壞血酸棕櫚酸酯、迷迭香提取物、竹葉提取物、VE油。前一組抗氧化劑配制成10 μg/mL；后一組抗氧化劑配制成30 μg/mL。分別測定不同反應時間下，測定反應體系在517 nm處的吸光度值，計算抗氧化劑對DPPH自由基的清除率，繪制抗氧化劑與DPPH自由基的反應動力學曲線；根據12種抗氧化劑對ABTS＋的清除率計算得到的 IC50值，將抗氧化劑分為兩組：一組為：單寧酸、茶多酚、TBHQ、BHA、抗壞血酸、蘆丁、BHT、D-異抗壞血酸鈉；另一組為抗壞血酸棕櫚酸酯，迷迭香提取物，竹葉提取物，VE油。前一組試樣配制成100 μg/mL；后一組試樣配制成600 μg/mL。分別測定不同反應時間下，測定反應體系在734 nm處的吸光度值，計算抗氧化劑對ABTS＋的清除率，繪制抗氧化劑與ABTS＋的反應動力學曲線。結果：TBHQ、抗壞血酸、D-異抗壞血酸鈉、抗壞血酸棕櫚酸酯、VE油與DPPH自由基反應時，反應速率很快，反應很快達到平衡。而單寧酸、茶多酚、BHA、蘆丁、BHT、迷迭香提取物與竹葉提取物的與DPPH自由基反應時，其對DPPH自由基清除率隨著反應時間延長顯著增加。在反應初期（6 min時），各試樣DPPH自由基清除能力按如下強弱順序排列：單寧酸＞茶多酚＞TBHQ＞BHA＞抗壞血酸＞蘆丁＞D-異抗壞血酸鈉＞BHT；而在反應時間為18 min時，各試樣DPPH?清除能力的強弱順序發生改變：單寧酸＞茶多酚＞TBHQ＝BHA＞蘆丁＞抗壞血酸＞BHT＞D-異抗壞血酸鈉；在反應時間為42 min時，BHT的DPPH自由基清除能力超過抗壞血酸的DPPH自由基清除能力。BHA、抗壞血酸、TBHQ、D-異抗壞血酸鈉、VE油的 ABTS＋清除能力隨時間延長無顯著性變化，其與ABTS＋的反應速率很快，反應很快達到平衡。而單寧酸、茶多酚、蘆丁、BHT、竹葉提取物、迷迭香提取物、抗壞血酸棕櫚酸酯的 ABTS＋清除能力隨時間延長顯著增加。在反應初期（6 min時），各試樣 ABTS＋清除能力按如下強弱順序排列：單寧酸＞茶多酚＞蘆丁＞BHA＞抗壞血酸＝TBHQ＝BHT＞D-異抗壞血酸鈉；而在反應時間為12 min時，BHT的ABTS＋清除能力超過了BHA、抗壞血酸、TBHQ。另外，在反應初期（6 min時），各試樣ABTS＋清除能力按如下強弱順序排列：抗壞血酸棕櫚酸酯＞竹葉提取物＞迷迭香提取物＞VE油；而當反應時間為24 min時，竹葉提取物的 ABTS＋清除能力超過抗壞血酸棕櫚酸酯。結論：不同抗氧化劑因其結構的差異，與DPPH自由基、ABTS＋反應速率不同，反應到達平衡的時間不同，若反應時間短暫，可能對抗氧化劑的抗氧化性評價帶來錯誤的判斷。采用DPPH法、ABTS＋法評定試樣抗氧化活性時，當反應時間延長到60 min時，試樣的DPPH自由基、ABTS＋清除能力排序已經趨于穩定。因此，可選用反應時間60 min作為DPPH法、ABTS＋法評價試樣抗氧化活性強弱的最佳反應時間。

來源出版物：食品科學, 2010, 31(5): 63-67

入選年份：2015