結腸癌中p—mTOR、p—p70S6K的表達與臨床病理意義

趙溢斐+周逢強+徐宏

【摘要】 目的：探討磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）及其下游因子p-p70S6K在結腸癌中的表達情況，分析其與臨床病理特征的關系。方法：應用免疫組織化學方法檢測結腸癌組織、癌旁組織、正常結腸組織中p-mTOR、p-p70S6K的表達。結果：81例結腸癌組織中p-mTOR表達率為51.85%（42/81），顯著高于正常結腸組織的21.74%（5/23）、癌旁組織35.80%（29/81），且p-mTOR的表達與TNM分期、結腸癌解剖位置相關（ 字2=7.617、5.358，P<0.05）。p-p70S6K在結腸癌的表達率為72.84%（59/81），且與p-mTOR的表達呈正相關（r=0.356，P=0.001）。結論：p-mTOR、p-p70S6K蛋白在結腸癌組織中高表達，且與結腸癌的發生、解剖部位、TNM分期有關，可作為結腸癌診斷和預后判斷的指標。

【關鍵詞】 p-mTOR； p-p70S6K； PI3K/AKT通路； 結腸癌

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of mammalian target of rapamycin pamptomycin target protein（p-mTOR） and its downstream factor p-p70S6K in colonic carcinoma，and to analyze its relationship with clinicopathological features.Method：The p-mTOR and p-p70S6K expression was detected in normal，adjacent，and colonic carcinoma tissues using immunohistochemical method.Result：The expression rate of p-mTOR in 81 cases of colonic carcinoma was 51.85%（42/81），which was significantly higher than that in normal tissues（21.74%，5/23） or adjacent tissues（35.80%，29/81），and the expression of p-mTOR was correlated with TNM stage and colonic carcinoma location（ 字2=7.617，5.358，P<0.05）.The expression rate of p-p70S6K in colonic carcinoma was 72.84%（59/81） and was positively correlated with the expression of p-mTOR（r=0.356，P=0.001）.Conclusion：p-mTOR，p-p70S6K protein is highly expressed in colorectal cancer tissues and is related to the occurrence，anatomical site and TNM staging of colon cancer，which can be used as an index for the diagnosis and prognosis of colon cancer.

【Key words】 p-mTOR； p-p70S6K； PI3K/AKT pathway； Colorectal cancer

First-authors address：Binzhou Medical University，Yantai 264003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.02.011

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，多種信號通路匯聚于上，作為多種通路的中心環節，mTOR整合上游的信號和能量，控制基因的轉錄和蛋白質的合成，并且在腫瘤細胞的發生、血管生成、浸潤、轉移及化療耐藥中也發揮了重要作用[1-4]。核糖體S6蛋白激酶（P70S6K）為mTOR下游因子，在蛋白質翻譯的延長階段能加快翻譯速度，進而促進細胞的侵襲和轉移。p-mTOR、p-p70S6K分別是mTOR、p70S6K其磷酸化形式。研究表明，p-mTOR、p-p70S6K在多種實體腫瘤中異常表達[5-7]。因此，本實驗以PI3K/AKT通路中的兩個重要蛋白p-mTOR和p-p70S6K為觀察指標，通過檢測結腸癌組織、癌旁組織、正常結腸組織中上述蛋白的表達情況，探討兩者對結腸癌病理參數的影響并驗證兩者表達的相關性。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選取濱州市人民醫院胃腸外科2016年2月-2017年2月結腸癌根治術病理標本共81例，所有病例術前均無化療、放療、靶向治療及免疫治療史。其中男45例，女36例；年齡33～81歲，平均62歲；其中右半結腸37例，左半結腸44例；腫瘤直徑>3 cm 53例，腫瘤直徑≤3 cm 28例；按照TNM臨床分期標準分為Ⅰ期11例，Ⅱ期27例，Ⅲ期38例，Ⅳ期5例；伴有淋巴結轉移57例，無淋巴結轉移24例；有遠處轉移5例，無遠處轉移76例。同時取81例距腫瘤邊緣5 cm以遠的癌旁結腸組織、23例外傷患者的正常結腸組織作為對照。

1.2 主要試劑 p-mTOR兔抗人多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司，p-p70S6K兔抗人多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司，檸檬酸抗原修復液、磷酸鹽緩沖液（PBS）及二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑均購自福州邁新生物技術公司。endprint

1.3 試驗步驟 所有標本離體常規固定、脫水及石蠟包埋行厚4 μm連續切片，用Envision二步法免疫組化染色，p-mTOR、p-p70S6K一抗的工作濃度為1∶100，常規二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復，一抗和二抗分別孵育、二氨基聯苯胺顯色、蘇木素復染，中性樹脂封片觀察。用已知陽性的切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖溶液代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判定標準 p-mTOR蛋白主要定位于細胞質，部分位于細胞膜，陽性者細胞質可見黃色顆粒，p-p70S6K蛋白定位在細胞核，陽性染色為棕黃色或棕褐色顆粒樣物質。每個標本至少計數100個細胞，基于染色強度和p-mTOR陽性腫瘤細胞百分比進行評分。染色強度：0分（無染色）、1分（弱染色）和2分（強染色），用染色強度乘以陽性細胞所占的比例，≤20為陰性，>20為陽性[8]。以上結果均至少由兩位病理科醫生以雙盲法觀察確定。

1.5 統計學處理 使用統計分析軟件SPSS 21.0進行數據處理。計數資料以率表示，多組比較采用 字2檢驗，多組間兩兩比較的顯著性水平經Bonferroni校正，相關性采用Spearman檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p-mTOR蛋白在結腸癌中的表達及與病理參數的關系 p-mTOR在正常組織、癌旁組織、癌組織中的表達率分別為21.74%（5/23）、35.80%（29/81）、51.85%（42/81），比較差異有統計學意義（ 字2=8.370，P<0.05）。結腸癌中p-mTOR陽性率高于正常組織（ 字2=6.558，P<0.05），癌旁組織和正常組織無明顯差異（P>0.05）。在臨床病理參數中，p-mTOR蛋白表達率與TNM分期、結腸癌解剖位置相關（ 字2=7.617、5.358，P<0.05），但與分化程度、淋巴結轉移無關（ 字2=2.026、2.138，P>0.05）。見表1、2及圖1。

2.2 p-p70S6K蛋白在結腸癌中的表達及與病理參數的關系 p-p70S6K在正常組織及癌組織中的陽性率分別為38.10%（8/21）、56.79%（46/81）、72.84% （59/81），比較差異有統計學意義（ 字2=10.036，P<0.05）。結腸癌中p-p70S6K陽性率高于正常組織（ 字2=8.932，P<0.05），癌旁組織和正常組織無明顯差異（P>0.05）。在臨床病理參數中，p-p70S6K表達率與TNM分期、結腸癌解剖位置均相關（ 字2=7.675、6.164，P<0.05），但與分化程度、淋巴結轉移均無關，差異均無統計學意義（ 字2=3.244、2.277，P>0.05）。見表1、2及圖2。

2.3 p-mTOR與p-p70S6K表達的相關性 在81例結腸癌組織中，p-mTOR陽性表達42例中，p-p70S6K蛋白有陽性表達占37例，而p-mTOR表達陰性的39病例中，p-p70S6K蛋白陰性的占17例。經Spearman秩相關檢驗，顯示p-mTOR及p-p70S6K蛋白在結腸癌組織中的表達呈正相關（r=0.356，P=0.001）。

3 討論

信號通路的異常活化與腫瘤的發生、侵襲、轉移密切相關。PI3K/AKT在細胞內發揮著抑制凋亡，促進增殖的作用。研究表明，PI3K/AKT通路在正常組織中處于失活狀態，但在腫瘤組織中會異常激活[9]。PI3K/AKT通路的激活將賦予腫瘤細胞巨大的生長優勢，使蛋白質合成量增加，同時抑制自噬，使得腫瘤細胞即使以高速增殖，也不易凋亡[10]。

mTOR是近年來發現的在進化上高度保守的蛋白激酶，其基因定位于1號染色體短臂，與細胞的凋亡、增殖、遷移、周期調控均密切相關。mTOR作為PI3K/AKT通路的下游蛋白，以其磷酸化形式p-mTOR在細胞內發揮活性[11]。然而，PI3K/AKT信號通路的激活，并未增加mTOR蛋白表達量，而是促進mTOR的磷酸化，在現有mTOR蛋白的基礎上提高p-mTOR的占比[12]。所以，針對p-mTOR蛋白的研究更能反映出該通路在細胞內的激活程度。Cao等[13]發現p-mTOR在胃癌組織中的表達顯著高于正常組織和癌旁組織。Murayama等[14]發現，胃癌中p-mTOR的表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結受累、TNM分期均呈正相關。Gille等[15]證實，p-mTOR能作用于血管內皮細胞，選擇性激活VEGF（血管內皮生長因子），誘導血管生成，保障實體腫瘤的血供，為血行播散提供結構基礎。Melling等[16]發現p-mTOR在左半結腸癌的表達率顯著高于右半結腸癌，并推測其與微衛星不穩定性（MSI）及遺傳性非息肉病結腸癌綜合征（HNPCC）在左半結腸癌中的發生率較低有關。Ueng等[17]研究表明p-mTOR與乳腺癌的生存期相關。這提示p-mTOR的表達可能對結腸癌的發生、侵襲、轉移、分化程度及遠期預后均有一定影響。

在體內p-mTOR通過磷酸化多種蛋白來發揮其生理作用，p70S6K則是其最重要的底物之一。p70S6K存在于mRNA的5帽端，p-mTOR磷酸化其T389位點使其激活。研究表明，p-p70S6K能激活細胞周期依賴性蛋白激4（CDK4）[18]、細胞周期素（Cyclin）[19]，加快細胞分裂G期進展，縮短細胞周期，促進腫瘤的發生。Wang等[20]發現，p-p70S6K作用于真核生物延長因子2（eEF2）、細胞程序性死亡蛋白（PDCD4）提高mRNA的翻譯速度，促進腫瘤的增殖。Park等[21]證實，p-p70S6K可促進肌動蛋白細絲重構，促進細胞運動，導致腫瘤的侵襲和轉移。

在本實驗中，筆者發現p-mTOR、p-p70S6K蛋白在結腸癌中的表達率顯著高于正常結腸組織、癌旁組織（P<0.05），說明結腸癌發生與p-mTOR、p-p70S6K蛋白關系密切。本實驗還發現，p-mTOR、p-p70S6K蛋白的表達與TNM分期密切相關，但與腫瘤的直徑、分化程度、淋巴結轉移無關，這與Murayama等[14]的結果有一定的差異，可能是標本組織的來源不同導致的腫瘤生物學行為的差異。根據實驗結果，筆者發現p-mTOR在左半結腸癌的表達率顯著高于右半結腸癌，但具體機制目前不甚明了，Melling等[16]曾推測其與微衛星不穩定有關，但目前尚缺乏實驗數據支持，有待進一步研究。endprint

本研究結果為進一步研究參與結腸癌細胞發生、侵襲、轉移等的具體機制提供了一定的研究思路，同時聯合檢測結腸癌中p-mTOR及p-p70S6K蛋白的表達有利于了解結腸癌的生物學行為，為結腸癌的早期診斷、靶向治療、預后判斷提供了一個有效的靶點。

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（收稿日期：2017-09-25） （本文編輯：程旭然）endprint