大蒜素對(duì)慢性腎衰大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

楊雅楠

0 引言

慢性腎功能衰竭(Chronic renal failure，CRF)是各種腎臟疾病終末期的共同表現(xiàn)，病程不可逆且進(jìn)行性加重[1]，目前尚無法治愈，臨床上主要采取透析、降脂、抗聚、抗凝等治療措施以緩解CRF癥狀并延緩病情發(fā)展[2-3]，因此，CRF一直是醫(yī)藥研究者關(guān)注的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。既往Locatelli等[4]和楊婧等[5]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)是慢性腎病發(fā)生發(fā)展的重要因素，并且與患者預(yù)后密切相關(guān)。大蒜素是一種具有抗氧化、抗凋亡等多種藥理學(xué)作用的二烯丙基三硫化物，但其對(duì)CRF大鼠氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)是否具有抑制作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過制備CRF大鼠模型并給予大蒜素進(jìn)行干預(yù)治療，探討大蒜素對(duì)CRF大鼠氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物與試劑 SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，180～220 g，河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(冀)：2013-1-003]。大蒜素注射液(黑龍江江世藥業(yè)有限公司，規(guī)格：2 mL∶30 mg)；H&E試劑盒和SOD、CAT、MDA、T-AOC、AOPPs、CRP、IL-1、IL-6、TNF-α、sICAM-1、VCAM-1試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；BUN、SCr、UA試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；腺嘌呤(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組、模型制備與給藥 100只實(shí)驗(yàn)用大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、大蒜素(5、10、20 mg/kg)組，每組20只。參照杜卉蓮等[8]研究報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法制備CRF大鼠模型：25%腺嘌呤溶液250 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃21 d，制備CRF大鼠模型，正常對(duì)照組給予正常飲食、水。造模完成后，大蒜素5、10、20 mg/(kg·d)組腹腔注射治療，正常對(duì)照組與模型對(duì)照組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，療程為28 d。

1.3 檢測指標(biāo) ①收集24 h尿量，通過生化分析儀測定24 h尿蛋白量。②血清腎功能指標(biāo)檢測：腹主動(dòng)脈取血(不抗凝)，離心取血清，通過生化分析儀測定血清BUN、SCr、UA含量。③腎臟指數(shù)的計(jì)算：實(shí)施麻醉后取腎臟，稱量左側(cè)腎臟重量，腎臟指數(shù)=左側(cè)腎臟重量/體重。④腎臟組織病變的觀察：取稱量后左側(cè)腎臟置于4%多聚甲醛溶液固定72 h，然后行石蠟包埋、切片、展片和脫蠟水化處理，行常規(guī)H&E染色后，通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。⑤腎臟組織抗氧化酶活性和MDA含量測定：取右側(cè)腎臟、加入適量冷裂解液行研磨勻漿，離心(3 000 r/min，10 min)取上清液，按試劑盒說明，通過化學(xué)比色法測定腎臟組織SOD、CAT活性和MDA含量。⑥血清中T-AOC和AOPPs水平的測定：腹主動(dòng)脈取血(不做抗凝處理)，離心(1 500 r/min，10 min)取血清，采用化學(xué)比色法測定血清中T-AOC和AOPPs水平。⑦血清中炎癥因子含量測定：參照各指標(biāo)ELISA檢測試劑盒操作說明，通過酶標(biāo)儀檢測血清中AOPPs、CRP、IL-1、IL-6、TNF-α、sICAM-1、VCAM-1含量水平。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素對(duì)CRF大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白量的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠24 h尿量顯著增加、24 h尿蛋白量顯著升高(P<0.01)。經(jīng)大蒜素10、20 mg/(kg·d)治療28 d后，CRF大鼠24 h尿量和24 h尿蛋白量顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表1。

2.2 大蒜素對(duì)CRF大鼠體重、腎臟指數(shù)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠體重和腎臟指數(shù)均升高(P<0.01)；經(jīng)大蒜素10、20 mg/(kg·d)治療28 d后，大鼠體重升高(P<0.05)，腎臟指數(shù)降低(P<0.01)。見表1。

2.3 大蒜素對(duì)CRF大鼠血清腎功能指標(biāo)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清腎功能監(jiān)測指標(biāo)(BUN、SCr、UA含量)升高(P<0.01)；經(jīng)大蒜素10、20 mg/(kg·d)治療28 d，上述指標(biāo)降低(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表1 各組大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白量、體重、腎臟指數(shù)比較

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.4 大蒜素對(duì)CRF大鼠腎臟組織病變的影響 觀察各組大鼠腎臟HE染色病理切片：正常對(duì)照組大鼠腎小球、腎小管及間質(zhì)區(qū)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)均未見異常；模型對(duì)照組呈現(xiàn)腎小球變性、數(shù)量減少、球囊黏連、囊腔和管腔擴(kuò)大，腎小管內(nèi)結(jié)晶、壞死處可見大量炎癥細(xì)胞和少量中性粒細(xì)胞浸潤；與模型對(duì)照組比較，經(jīng)大蒜素5、10、20 mg/(kg·d)治療28 d，CRF大鼠腎臟組織病變明顯改善，以20 mg/(kg·d)組最為顯著。見圖1。

2.5 大蒜素對(duì)CRF大鼠腎臟組織抗氧化酶活性和MDA含量的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠抗氧化酶活性顯著降低，MDA含量顯著升高(P<0.01)；經(jīng)大蒜素10、20 mg/(kg·d)治療28 d，CRF大鼠SOD活性升高，降低MDA含量(P<0.05或P<0.01)，經(jīng)20 mg/(kg·d)治療,能夠升高CAT活性(P<0.01)。結(jié)果見表3。

2.6 大蒜素對(duì)CRF大鼠血清T-AOC、AOPPs水平的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清T-AOC水平降低(P<0.01)，AOPPs水平升高(P<0.01)；經(jīng)大蒜素10、20 mg/(kg·d)治療28 d,CRF大鼠AOPPs水平降低(P<0.05或P<0.01)；經(jīng)大蒜素20 mg/(kg·d)治療,T-AOC水平升高(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表2 各組大鼠血清腎功能監(jiān)測指標(biāo)

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖1 各組大鼠腎臟組織病變(HE，400×)

組別只數(shù)SOD(U/mgprot)CAT(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)正常對(duì)照組2013.1±1.82.5±0.64.6±1.1模型對(duì)照組206.4±1.0**1.2±0.4**15.2±2.3**大蒜素5mg/(kg·d)組207.1±1.31.5±0.313.0±2.7大蒜素10mg/(kg·d)組208.9±1.5#1.6±0.48.1±1.6##大蒜素20mg/(kg·d)組2011.2±1.6##1.9±0.6##6.3±1.2##

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01

表4 各組大鼠血清T-AOC、AOPPs水平比較

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.7 大蒜素對(duì)CRF大鼠血清sICAM-1、VCAM-1含量的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清sICAM-1、VCAM-1含量升高(P<0.01)；經(jīng)大蒜素10、20 mg/(kg·d)治療28 d，CRF大鼠血清sICAM-1、VCAM-1含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表5。

表5 各組大鼠血清sICAM-1、VCAM-1含量比較

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.8 大蒜素對(duì)CRF大鼠血清CRP、IL-1、IL-6、TNF-α含量的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清hs-CRP、IL-1、IL-6、TNF-α含量升高(P<0.01)；經(jīng)大蒜素10、20 mg/(kg·d)治療28 d，CRF大鼠血清CRP、TNF-α含量降低(P<0.05或P<0.01)；經(jīng)大蒜素20 mg/(kg·d)治療，CRF大鼠血清IL-1、IL-6含量降低(P<0.05或P<0.01)。見表6。

3 討論

在已知CRF發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制中，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6-8]，這也為新型抗CRF藥物的研究提供了新的思路。大蒜素是一種具有多種生物學(xué)活性的二烯丙基三硫化物[4-5]，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素治療28 d，能夠有效減少CRF大鼠排尿量，降低24 h尿蛋白量，降低血清BUN、SCr、UA含量，抑制CRF大鼠腎臟組織病變，降低腎臟指數(shù)，提示大蒜素對(duì)CRF大鼠腎臟具有一定的保護(hù)作用。

既往Locatelli等[4]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激損傷與慢性腎病發(fā)生發(fā)展及患者預(yù)后密切相關(guān)。機(jī)體組織抗氧化酶活性降低是導(dǎo)致氧自由基(ROS)過剩的主要原因，腎臟組織SOD、CAT含量豐富，是清除ROS而抑制氧化應(yīng)激損傷的重要屏障[9]。韓海燕等[10]研究顯示，抗氧化酶活性降低將導(dǎo)致ROS蓄積而引發(fā)脂質(zhì)過氧化損傷，MDA含量升高。T-AOC水平能夠反映機(jī)體整體抗氧化能力；AOPPs是一種氧化修飾蛋白，為常用體內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物[11]。Li等[12]報(bào)道，持續(xù)靜脈注射AOPPs，能夠加重慢性腎病動(dòng)物氧化應(yīng)激損傷，此外，既往研究發(fā)現(xiàn)，AOPPs能夠介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素治療28 d，能夠有效改善CRF大鼠腎臟組織抗氧化酶(SOD、CAT)活性并降低MDA含量，提高血清T-AOC水平并降低AOPPs水平，提示大蒜素具有抑制CRF大鼠氧化應(yīng)激損傷的作用。

血清炎癥細(xì)胞因子(CRP、IL-1、IL-6、TNF-α)含量水平是臨床監(jiān)測機(jī)體炎癥反應(yīng)的常用指標(biāo)，而sICAM-1、VCAM-1含量與炎性細(xì)胞浸潤密切相關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素治療28 d，能夠有效降低CRF大鼠血清CRP、IL-1、IL-6、TNF-α、sICAM-1、VCAM-1含量水平，進(jìn)而起到抑制炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，大蒜素能夠有效改善CRF大鼠腎功能，抑制腎臟組織病變，改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷，調(diào)節(jié)炎癥因子水平、抑制炎癥反應(yīng)，提示大蒜素可能通過降低氧化應(yīng)激損傷和抑制炎癥反應(yīng)，對(duì)CRF大鼠起到一定的保護(hù)作用。

表6 各組大鼠血清CRP、IL-1、IL-6、TNF-α含量比較

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01

[1] 吳鑫洪,丁國明,韓穎敏.腎衰寧聯(lián)合包醛氧淀粉治療慢性腎功能衰竭的臨床療效觀察[J].求醫(yī)問藥,2011,9(9):260-261.

[2] 馮青,萬毅剛,蔣春明,等.中藥延緩腎功能衰竭進(jìn)展的機(jī)制和效果[J].中國中藥雜志,2011,36(9):1122-1128.

[3] 王磊.血液透析治療慢性腎功能衰竭的臨床療效觀察[J].中國實(shí)用醫(yī)藥,2011,6(25):52-53.

[4] Locatelli F,Canaud B,Eckardt KU,et al.Oxidative stress in end-stage renal disease:an emerging threat to patient outcome[J].Nephrol Dial Transplant,2003,18:1272-1278.

[5] 楊婧,嚴(yán)睿俊,王琛,等.腎衰II號(hào)方對(duì)慢性腎臟病患者腎功能及炎癥因子的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(12):15-18.

[6] 王明娟,耿永芝,劉景華,等.白藜蘆醇對(duì)抗酒精誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷作用:氧化應(yīng)激與凋亡[J].世界華人消化雜志,2014,22(36):5594-5601.

[7] 張宏睿,林永廉.大蒜素對(duì)糖尿病大鼠CRP、TNF-α、PAI-1及IL-6的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,10(2):34-35.

[8] 杜卉蓮,傅曉晴.慢性腎衰動(dòng)物的模型制備及臨床應(yīng)用[J].中醫(yī)研究,2005,18(12):53-57.

[9] Lartigue A,Burlat B,Coutard B,et al.The megavirus chilensis Cu,Zn-superoxide dismutase:the first viral structure of a typical CCS-independent hyperstable dimeric enzyme[J].J Virol,2014,2588(14):254-261.

[10]韓海燕,路建饒,王新華,等.腎衰方對(duì)5/6腎切除大鼠的氧化應(yīng)激和微炎癥的作用與機(jī)制[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2015,26(10):2391-2394.

[11]文志勇,毛萍,金召英,等.復(fù)方黃甘提取物對(duì)慢性腎衰大鼠氧化應(yīng)激的影響[J].中藥材,2012,35(6):957-961.

[12]Li HY,Hou FF,Zhang X,et al.Advanced oxidation protein products accelerate fibrosis in a remnant kidney model[J].J Am Soc Nephrol,2007,18(2):5232-5238.

[13]Witko-Sarat V,Friedlander M,Nguyen-Khoa T,et al.Advanced oxidation protein products as novel mediators of inflammation and monocyte activation in chronic renal failure[J].J Immunol,1998,161(5):2524-2532.

[14]王興紅,常陸林,王麗菲.槲皮素對(duì)糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激和血清炎癥相關(guān)因子的影響[J].中藥藥理與臨床,2014,30(4):39-42.