松花粉對急性汞中毒大鼠肝腎的保護作用及機制研究

王 蕾，謝月群，張 和

0 引言

松花粉(PiniPollen)是松科(Pinaceae)植物馬尾松(PinusmassonianaLamb.)、油松(PinustabuliformisCarr.)或同屬數種植物的干燥花粉[1]，含有豐富的黃酮、微量元素硒、維生素C、維生素E卵磷脂、酶類和多種植物激素等生物活性物質或營養物質[2-3]。研究表明，松花粉具有治療前列腺增生、促進鋅的吸收、抗衰老、抗疲勞、保護心腦血管、降低血脂、提高性功能、保肝等作用[3]。多項小鼠、大鼠實驗從改善學習記憶、保護肝細胞、保護腎臟、促血砷排泄、提高抗氧化能力、抑制大腦皮質細胞和腎臟細胞凋亡、促進造血等方面，研究松花粉對鉛、砷中毒的保護作用[2,4-9]。

汞及其化合物能通過多種途徑對機體產生以神經性、肝臟和腎臟毒性為主的多系統損害[10]。汞污染已成為一個全球性污染問題，隨著汞及其化合物的污染問題日益嚴重，如何預防及治療汞及其化合物對機體的毒性作用顯得極其重要[11]。故研發安全、有效的汞中毒防治藥物具有深遠的意義。本文通過皮下注射HgCl2溶液建立大鼠急性汞中毒模型，研究松花粉對急性汞中毒的保護作用和機制，以期為松花粉預防和治療急性汞中毒提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級健康SD大鼠50只，雌雄各半，體重(200±20)g (溫州醫科大學實驗動物中心)。松花粉(南京如來福生物工程有限公司)用0.5%CMC-Na制成0.2、0.4、0.8 g/mL的混懸液；HgCl2(上海試四赫維化工有限公司)用生理鹽水制成1 mg/mL的溶液。尿素氮(BUN)、尿蛋白、尿乳酸脫氫酶(LDH)、尿堿性磷酸酶(ALP)測試盒(南京建成生物工程研究所)；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)測試盒(上海朗頓生物科技有限公司)。高速離心機(上海醫用分析儀器廠)，高速組織勻漿機(艾卡廣州儀器設備有限公司)，7700型電感耦合等離子體質譜儀(美國Agilent公司)，680型酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組、給藥和樣品采集 50只SPF級健康SD大鼠，隨機分為正常對照組，染汞模型組，松花粉低、中、高劑量組(2、4、8 g/kg)，每組10只，雌雄各半。正常對照組大鼠按2.5 mL/kg劑量，皮下注射生理鹽水；其他組大鼠按2.5 mL/kg劑量，皮下注射1 mg/mL HgCl2溶液，連續2 d，建立急性汞中毒模型[11]。末次染汞后，對照組和染汞模型組分別按10 mL/kg劑量，灌胃給予0.5% CMC-Na；松花粉低、中、高劑量組(2、4、8 g/kg)分別按10 mL/kg劑量，灌胃給予0.2、0.4、0.8 g/mL的松花粉混懸液；每天早晚各1次，持續5 d。末次給藥后，將大鼠移入代謝籠中，收集12 h的尿液，用于測定尿汞、蛋白、LDH和ALP的含量或活性，在此期間停止食物供應，但給予自由取用去離子水。尿液收集12 h后，水合氯醛麻醉大鼠，將大鼠以仰臥位固定在手術操作臺上，剪開腹部皮毛，然后腹主動脈取血，靜置1 h，以3 000 r/min離心10 min，分離得到血清，用于測定血汞、BUN、ALT、AST和TBIL的含量或活性。將大鼠處死，解剖分離得到腎臟和肝臟，準確稱取腎臟和肝臟各1.0 g，分別加入9 mL生理鹽水，在冰浴上制成10%組織勻漿，以3 000 r/min離心10 min，獲得上清液，用于測定肝汞和腎汞及腎臟和肝臟中SOD、GSH-Px、GSH和MDA的含量或活性。

1.2.2 測定指標及方法 肝汞、腎汞、血汞和尿汞的含量通過7700型電感耦合等離子體質譜儀進行測定[12]。BUN、尿蛋白、尿LDH、尿ALP、血清ALT、血清AST和血清TBIL及腎臟和肝臟中SOD、GSH-Px、GSH和MDA的含量或活性均通過相應試劑盒進行測定。

2 結果

2.1 松花粉對急性汞中毒大鼠肝汞、腎汞、血汞和尿汞含量的影響 由表1可知，與正常對照組比較，染汞模型組大鼠肝汞、腎汞、血汞和尿汞含量均增加(P<0.01)，表明急性汞中毒模型造模成功。與染汞模型組比較，松花粉組大鼠肝汞、腎汞和血汞含量均降低(P<0.01)，松花粉低、中、高劑量組大鼠尿汞含量增加(P<0.05或P<0.01)，表明松花粉具有清除體內汞蓄積的作用。

2.2 松花粉對急性汞中毒大鼠BUN、尿蛋白、尿LDH和尿ALP含量或活性的影響 由表2可知，與正常對照組比較，染汞模型組大鼠BUN、尿蛋白、尿LDH和尿ALP含量或活性均增加(P<0.01)，表明急性汞中毒導致了大鼠急性腎損傷。與染汞模型組比較，松花粉低、中、高劑量組大鼠BUN、尿蛋白、尿LDH和尿ALP含量或活性均降低(P<0.05或P<0.01)，表明松花粉對急性汞中毒誘導的急性腎損傷具有一定的修復作用。

表1 各組大鼠肝汞、腎汞、血汞、尿汞含量比較

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與染汞模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

表2 各組大鼠BUN、尿蛋白、尿LDH、尿ALP含量或活性比較

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與染汞模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.3 松花粉對急性汞中毒大鼠血清ALT、AST、TBIL活性的影響 由表3可知，與正常對照組比較，染汞模型組大鼠血清ALT、AST和TBIL活性均顯著增加(P<0.01)，表明急性汞中毒引起了大鼠急性肝損傷。與染汞模型組比較，松花粉低、中、高劑量組大鼠血清ALT、AST和TBIL活性均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，表明松花粉對急性汞中毒誘導的急性肝損傷具有一定的修復作用。

表3 各組大鼠血清ALT、AST、TBIL活性比較

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與染汞模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.4 松花粉對急性汞中毒大鼠腎臟和肝臟中SOD、GSH-Px、GSH和MDA活性或含量的影響 由表4、表5可知，與正常對照組比較，染汞模型組大鼠腎臟和肝臟SOD、GSH-Px和GSH活性或含量均降低(P<0.01)，染汞模型組大鼠腎臟和肝臟MDA含量增加(P<0.01)，表明急性汞中毒引起了大鼠肝臟和腎臟的脂質過氧化損傷。與染汞模型組比較，松花粉低、中、高劑量組大鼠腎臟和肝臟SOD、GSH-Px和GSH活性或含量均增加(P<0.05或P<0.01)，松花粉低、中、高劑量組大鼠腎臟和肝臟中的MDA含量降低(P<0.05或P<0.01)，表明松花粉對急性汞中毒引起的腎臟和肝臟的脂質過氧化損傷具有一定的修復作用。

3 討論

HgCl2誘導的急性汞中毒大鼠模型被廣泛用于研發汞中毒防治藥物，HgCl2經皮下注射后迅速分布于各組織，其主要分布于腎臟和肝臟[11,13]。BUN、尿蛋白、尿LDH和尿ALP含量或活性是體現腎功能正常與否的重要指標，急性汞中毒可誘導急性腎損傷，進而導致BUN、尿蛋白、尿LDH和尿ALP含量或活性升高[11,13]。血清ALT、AST和TBIL活性是體現肝功能正常與否的重要指標，急性汞中毒可誘導急性肝損傷，進而導致血清ALT、AST和TBIL活性升高[14]。急性汞中毒可誘導脂質過氧化，進而損害肝臟和腎臟的正常功能[15]。MDA是脂質過氧化的重要產物，MDA可能引起細胞代謝及功能障礙，甚至死亡，其含量與細胞損傷的程度呈正相關，因此，測定MDA含量可反映機體內脂質過氧化的程度，間接反映細胞損傷的程度[16]。SOD、GSH-Px、GSH能夠抑制脂質過氧化的發生，進而防止脂質過氧化對組織的損害[17]。

表4 各組大鼠腎臟SOD、GSH-Px、GSH、MDA活性或含量比較

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與染汞模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

表5 各組大鼠肝臟SOD、GSH-Px、GSH、MDA活性或含量比較

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與染汞模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

研究發現，大鼠皮下注射HgCl2后，與正常對照組比較，其肝汞、腎汞、血汞、尿汞、BUN、尿蛋白、尿LDH、尿ALP、血清ALT、血清AST、血清TBIL、腎臟MDA和肝臟MDA含量或活性均顯著升高，腎臟和肝臟SOD、GSH-Px、GSH含量或活性均顯著降低。結果表明，HgCl2誘導的急性汞中毒大鼠模型造模成功，并且急性汞中毒可引起大鼠腎臟和肝臟的損傷，其機制可能與HgCl2誘導的脂質過氧化損傷相關。研究發現，灌胃給予急性汞中毒大鼠松花粉后，其尿汞含量進一步增加，上述其余指標均向正常對照組的數值變化。結果表明，松花粉具有清除體內汞蓄積、修復急性汞中毒誘導的急性肝腎損傷的作用，其機制與抑制脂質過氧化損傷相關。本研究較全面地研究了松花粉通過抑制脂質過氧化損傷對急性汞中毒肝腎的保護作用，但對于分子生物機制并無闡述，進一步的研究應該從松花粉的具體分離成分入手，研究其藥效，并分析其作用信號通路。

[1] 衛瑩芳,吳啟南,陳隨清,等.中藥鑒定學[M].上海:上海科學技術出版社,2010:270.

[2] 仕薇琳,任紫嫣,曹存鳳,等.松花粉對鉛中毒小鼠學習和記憶障礙的改善作用[J].食品科學,2014,35(19):277-279.

[3] 何曉燕,孫雪圓,于智洋.松花粉的有效成分及藥理作用[J].東北林業大學學報,2007,35(9):78-80.

[4] 趙全罡,羅艷紅.松花粉對砷中毒小鼠肝組織ALT活性的影響[J].檢驗醫學與臨床,2012,9(20):2635-2636.

[5] 羅艷紅,黃曉敏,韋文龍,等.松花粉對砷中毒大鼠的防護作用[J].右江民族醫學院學報,2007,29(1):24-25.

[6] 韋利英,羅艷紅,羅鳳芬,等.松花粉對砷中毒小白鼠肝臟RNA含量及其尿酸含量的影響[J].右江民族醫學院學報,2009,31(2):185-186.

[7] 羅艷紅,韋耀東,王太重,等.松花粉對砷中毒小鼠大腦皮質細胞凋亡相關因子和蛋白的影響[J].環境與健康雜志,2011,28(7):586-588.

[8] 羅艷紅,于沛濤,王太,等.松花粉對砷中毒小鼠腎臟細胞凋亡的影響[J].臨床醫藥實踐,2010,19(4B):425-426.

[9] 羅鳳芳,羅艷紅,韋利英,等.松花粉對砷中毒小鼠血象的影響[J].右江民族醫學院學報,2009,31(1):21-22.

[10]臧琳,姜登東.汞對人體的危害及其預防[J].中國勞動防護用品,1999,(1):36-37.

[11]鄭捷,鄭宇翔,肖鳳霞,等.土茯苓對急性汞中毒大鼠的保護作用研究[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(4):163-166.

[12]李偉東,張志杰,陳逸君,等.電感耦合等離子體光譜法/質譜法測定自然銅不逃跑制品中砷鉛銅鎘汞的含量[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(24):181-186.

[13]鄭光耀,陳茂銓,何玲,等.松針葉綠素-胡蘿卜素軟膏對汞中毒大鼠防治作用的研究[J].時珍國醫國藥,2012,23(6):1402-1403.

[14]劉東寬,楊進.急性汞中毒肝臟損害1例報告[J].中國工業醫學雜志,2005,18(3):142.

[15]景友玲,王艷蕾,耿菲,等.急性汞中毒與氧化應激反應的實驗研究[J].工業衛生與職業病,2010,36(4):230-233.

[16]王曉綱.白芍總苷對動脈粥樣硬化大鼠氧化應激和炎癥反應的抑制作用[J].實用藥物與臨床,2017,20(2):140-143.

[17]Wang HF,Zhong XH,Shi W,et al.Study of malondialdehyde (MDA),superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) activities in chickens infected with avian infectious bronchitis virus[J].Afr J Biotechnol,2011,10(5):9213-9217.