異甘草素對失血性休克大鼠動物模型腎臟EPCR表達的影響及其腎臟功能保護機制

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0 引言

研究表明，大約1/3的失血性休克(Hemorrhagic shock，HS)患者會發生急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)[1]。AKI會導致HS患者多器官衰竭發病率和死亡率增加[2]。腎臟組織對血液低灌注和缺氧非常敏感[3]。目前，已將抗炎和抗凝列為HS新的治療靶點。血管內皮細胞廣泛參與機體的炎癥反應與凝血過程。近年來發現，內皮細胞蛋白C受體(Endothelial protein C receptor，EPCR)是新型蛋白受體，是體內蛋白激酶C系統的重要組成[4-5]。在血管內皮細胞受到損傷后，內皮細胞釋放大量EPCR，增加了血漿中的可溶性EPCR。目前，血管內皮細胞受損可采用血漿中可溶性EPCR的水平來體現與表征。

異甘草素(Isoliquiritigenin，ISO)作為異黃酮類化合物的一種，在豆科植物甘草的根、黃芪、滇黃精的根、豆芽、鷹嘴豆的幼苗、串果藤、香殊蘭的球莖等中大量存在[6-7]。異甘草素在抗病毒、抗炎、抗血管生成、催眠等方面具有較好的效果，現代藥理學研究發現，其可以降低TNF-α等炎癥因子的表達，減輕血管內皮細胞的損傷[8-9]。本研究旨在通過失血性休克大鼠模型，以血清尿素氮和肌酐水平以及腎組織EPCR的表達水平為研究指標，觀察HS前后的改變，初步探討HS早期AKI損傷的發生機制以及異甘草素的干預作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 戊巴比妥鈉、林格液和異甘草素購自上海阿拉丁試劑有限公司，Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，瓊脂糖凝膠購自美國Sigma公司，兔抗大鼠EPCR單克隆抗體、β-actin抗體和二抗購自美國R&D Systems公司；UniCel DxC 800型全自動生化分析儀來源于美國Beckman Coulter公司，Gene Amp PCR System 2400型購自美國PE等。

1.2 動物分組 成年SD大鼠75只，雄性，周齡7周左右，體重250～300 g，由實驗動物中心提供。隨機分為5組：空白對照組(C組)、假手術組(S組)、失血性休克組(HS組)、林格液復蘇組(R組)和異甘草素復蘇組(I組)，每組15只。動物房溫度維持在(25.0±0.5)℃，采用常規飼料喂養，自由飲水。

1.3 失血性休克模型的建立 參考Umeda等[10]的方法。50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射，待麻醉后將其仰臥并于鼠板上固定。C組：無其他操作，6 h后取外周血和腎組織。其余四組均進行股動靜脈插管。分離右側股動脈，使用PowerLab 15T行動脈插管，通過三通及壓力傳感器，動脈插管與多功能監護儀相連，對平均動脈壓進行監測。經股靜脈放血，液體復蘇。S組：動靜脈插管后無其他操作，在6 h后對外周血和腎組織進行取樣。HS組：在插管成功后15 min內進行放血，并使MAP降至35 mmHg，使其穩定60 min，即為HS造模成功。6 h后取外周血和腎組織。林格液復蘇組：造模成功后，30 min內輸注3倍失血量的林格液復蘇。于造模成功6 h后取外周血和腎組織。I組：異甘草素20 μg/mL，再輸入林格液補充至失血量3倍，所有液體在30 min內輸完。于造模成功6 h后取外周血和腎組織。

1.4 反轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR) 應用RT-PCR檢測腎組織EPCR mRNA的表達。參考上海生工生物工程技術服務有限公司基因庫設計合成，EPCR引物系列：上游引物：5′-TCTACCTGTCCCAGTTCAA-3′；下游引物：5′-CATACCGAGTCCGATTGT-3′。β-actin引物系列：上游引物：5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′；下游引物：5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′。采用Trizol試劑盒對總RNA進行提取。按Takara公司說明書步驟在Gene Amp PCR System 2400型嚴格操作反轉錄合成cDNA。PCR循環條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，EPCR 53.3 ℃，β-actin 58 ℃，分別退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30～32個循環；循環結束后于72 ℃延伸5 min，-20 ℃保存備用。將5 μL PCR擴增產物與1 μL 6×Loading buffer液相混勻后進行瓊脂糖(1.5%)電泳，5 V/cm條件，灰度掃描采用Gel 3.0進行分析。目的基因mRNA水平的相對指標為目的基因與β-actin的PCR產物條帶的灰度之比。

1.5 Western blot檢測 腎臟組織經過研磨、裂解后，通過酶標儀測定蛋白濃度。上樣總蛋白質量為80 μg，經SDS-PAGE凝膠電泳分離后，將蛋白質通過電印跡轉移法轉至PVDF膜，采用麗春紅S染色，并根據所需要的目標條帶進行剪膜，用含有脫脂奶粉(質量濃度為5%)的TBS-T溶液在室溫下封閉2 h，分別加入兔抗大鼠EPCR單克隆抗體和β-actin抗體，于4 ℃下過夜孵育，在室溫下采用TBS-T溶液洗膜，隨后加入二抗進行孵育2 h，用TBS-T溶液洗膜后與ECL試劑進行反應，膠片曝光，掃描膠片，用Image J軟件計算條帶光密度(OD)值，以EPCR與β-actin條帶的OD比值來評定蛋白質的表達水平。

1.6 病理損傷評分系統 腎小管受損采用以下損傷評分系統：0分：沒有腎小管上皮細胞凋亡、管腔擴張或出血；1分：<5%的腎小管出現上皮細胞凋亡，管腔擴張或出血；2分：5%～25%的腎小管出現上皮細胞凋亡，管腔擴張或出血；3分：25%～75%的腎小管出現上皮細胞凋亡，管腔擴張或出血；3分：>75%的腎小管出現上皮細胞凋亡，管腔擴張或出血。

1.7 血清尿素氮和肌酐水平檢測 取大鼠外周血2 mL，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，采用UniCel DxC 800型全自動生化分析儀(Beckman Coulter，美國)測量血清尿素氮和肌酐水平。

2 結果

2.1 大鼠腎組織EPCR mRNA水平比較 與C組比較，S組腎組織EPCR mRNA的表達有所增加，但差異無統計學意義(P>0.05)；與C組和S組比較，HS組腎組織EPCR mRNA的表達顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與HS組比較，R組腎組織EPCR mRNA的表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與HS組和R組比較，I組腎組織EPCR mRNA的表達顯著降低，差異有統計學意義(P<005)。見圖1。

圖1 大鼠腎組織EPCR mRNA水平比較

2.2 大鼠腎組織EPCR蛋白質水平比較 與C組比較，EPCR蛋白質腎組織的表達在S組稍有增加，但是差異無統計學意義(P>0.05)；與C組和S組比較，HS組均明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與HS組比較，林格液復蘇后表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；I組較HS組和R組的腎組織EPCR 蛋白質表達亦明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 大鼠腎組織EPCR蛋白質水平比較

2.3 大鼠血清尿素氮和肌酐水平比較 與C組比較，S組血清尿素氮和肌酐的水平提升，但是差異無統計學意義(P>0.05)；與C組和S組比較，HS組均有明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與HS組比較，林格液復蘇后水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與HS組和R組比較，I組的血清尿素氮和肌酐的水平也顯著降低，且差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠血清尿素氮和肌酐水平比較

注：與HS組比較，*P<0.05；與R組比較，#P<0.05

2.4 大鼠腎臟組織損傷情況比較 HS組損傷評分明顯高于C組與S組，差異有統計學意義(P<0.05)；林格液和異甘草素復蘇后，腎臟組織損傷明顯減輕，損傷評分明顯低于HS組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 大鼠的腎組織損傷評分比較

3 討論

血管內皮細胞廣泛參與機體的炎癥與凝血過程。在機體發生HS時，血管內皮細胞大量表達各種免疫分子，如：Toll樣受體、補體受體及T淋巴細胞共刺激分子等。1994年，Fukudome等[11]首次根據基因克隆技術從內皮細胞基因文庫中獲得了一種能夠編碼蛋白質C結合位點的蛋白，即EPCR。EPCR分子結構與主要組織相容性復合物Ⅰ型分子相似，因此是一種Ⅰ型跨膜蛋白。EPCR通過與蛋白質C結合，可使蛋白質C的活化效率提高5～20倍[12]。EPCR在機體內以結合型和可溶型2種形式存在，結合型EPCR主要存在于大血管內皮細胞的表面，可溶型EPCR(sEPCR)來自于結合型EPCR。當內毒素或凝血酶與大血管內皮細胞接觸時，其通過蛋白酶介導結合型EPCR從血管內皮細胞表面脫落，以sEPCR的形式進入循環系統[13-14]。目前，有學者將血漿中sEPCR的水平作為反映血管內皮細胞受損的生物標志物[15]。

本研究結果表明,與C組比較，S組腎組織EPCR mRNA和蛋白質表達升高，但差異無統計學意義，表明創傷對腎臟組織EPCR的表達起到了誘導提升的作用，這可能與創傷導致的機體應激反應導致腎小管血管內皮細胞損傷有關。但是，因本研究S組的創傷較輕微(僅僅暴露了左股動靜脈)，其程度不足以導致腎組織EPCR mRNA和蛋白質的表達升高到有統計學意義的程度。HS組腎組織EPCR mRNA和蛋白質的表達顯著高于C組和S組，說明除創傷因素誘導腎小管血管內皮細胞受損之外，短時間內大量失血導致的休克參與誘導腎臟組織EPCR mRNA和蛋白質表達水平的增加。這可能是體內多種炎癥細胞因子共同作用的結果。經液體復蘇后，R組和I組腎臟組織EPCR mRNA和蛋白質的表達顯著低于HS組，表明失血性休克前期經過充足的液體復蘇，使血液得到了充分的補充，林格液和異甘草素都可以改善機體的微循環，以保護腎小管血管內皮細胞。另外，I組的EPCR mRNA和蛋白質表達水平更低，提示其抗凝和抗炎活性較高，與林格液比較，能夠更加有效地保護腎小管血管內皮細胞。另外，與C組比較，S組大鼠腎組織血清尿素氮和肌酐水平增加，但差異無統計學意義，說明創傷在一定程度上影響腎臟功能。HS組明顯高于C組和S組，提示除創傷因素導致腎功能障礙外，因短時間內大量失血導致腎臟缺氧和血流低灌注，嚴重影響了大鼠的腎功能。經液體復蘇后，R組及I組大鼠血清尿素氮和肌酐水平明顯低于HS組，提示失血性休克早期經過充分的液體復蘇，血液得到了補充，糾正了腎臟缺氧和血流低灌注，從一定程度上恢復了腎臟的正常功能。C組與S組的腎小管形態基本正常，HS組可見大量的腎小管上皮細胞損傷，損傷評分明顯高于C組與S組；經過林格液和異甘草素復蘇后，腎臟組織損傷明顯減輕。從形態學的角度再次證實了異甘草素可以保護失血性休克大鼠的腎功能。

綜上所述，失血性休克大鼠血清尿素氮和肌酐水平及腎臟組織EPCR表達增加，與失血性休克時急性腎臟損傷有關。異甘草素可以抑制腎組織EPCR的表達，從而起到保護腎臟功能的作用。

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