葡萄抵御霜霉病菌侵染的生理生化防衛反應研究

李寶燕+王英姿+姜法祥+石潔+劉學卿

摘要：為給葡萄抗霜霉病育種研究提供理論參考，通過田間調查結合室內接種的方法測定不同品種葡萄對霜霉病的抗性；測定接種葡萄霜霉病菌后，不同抗性品種葉片的SOD、POD、CAT活性及SA、H2O2、JA含量的變化；觀察噴施SA、H2O2、JA對葡萄霜霉病抗性的影響，明確萄萄抵御霜霉病菌侵染的生理生化防衛反應。結果表明，與感病品種相比，抗性品種的POD、CAT活性在接種病菌后迅速增強；不同品種的SA、H2O2含量在接種病原菌后與對照相比都有明顯升高，抗病品種升高出現早、生成量更高；不同品種葉片JA含量較對照雖有增加，但品種間無差異顯著性；水楊酸、茉莉酸、過氧化氫有助于增強葡萄對霜霉病的抗性，水楊酸增強抗性較為明顯，抗性增強44.87%。

關鍵詞：葡萄；霜霉病菌；不同品種；生理生化反應

中圖分類號：S436.631.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）01-0122-05

Abstract In order to provide theoretical references for grape resistance breeding against Plasmopara viticola， field investigation and indoor inoculation were used to detect the grape resistance to Plasmopara viticola. The changes of SOD， POD and CAT activities and SA， H2O2 and JA contents in leaves of different resistant varieties were determined after inoculation with Plasmopara viticola. The effects on grape resistance to Plasmopara viticola were observed after spraying SA， H2O2 and JA to clarify the physiological and biochemical defense responses of grape against the infection of Plasmopara viticola.The results showed that， compared with the susceptible varieties， the activities of POD and CAT were rapidly increased after inoculation. The contents of SA and H2O2 in different varieties increased obviously after inoculation compared with the control， and the resistant varieties showed earlier and higher formation amounts. JA content increased in different varieties， but there were no significant differences between cultivars. SA， JA and H2O2 were helpful to enhance the resistance of grape to Plasmopara viticola. SA enhanced the resistance obviously and the resistance was enhanced by 44.87%.

Keywords Grage；Plasmopara viticola； Different varieties； Physiological and biochemical response

葡萄霜霉病（grape downy mildew）主要侵染葡萄葉片、嫩梢和幼果，造成大量葉片干枯脫落[1]。由于葡萄霜霉病在整個生長季節，只要條件適宜，病原菌孢子會反復侵染，防治比較困難[2]，因此，及時開展葡萄霜霉病抗病機理的研究，對制定有效的可持續治理技術具有重要意義。

對葡萄霜霉病抗性機理的研究，主要涉及病程相關蛋白酶[超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物歧化酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、Glu等]、酚類物質活性、激素水平的變化[3-6]。關于酶活性變化與葡萄抗霜霉病關系研究眾多，但許多觀點不一致甚至相反[5-7]。水楊酸（SA）、過氧化氫（H2O2）、茉莉酸（JA）是參與植物防衛反應的重要信號分子[8，9]，參與調控植物抵御病原菌的侵染，從而增強抗性[10-12]。

山東沿海是國內主要葡萄產區，其生產規模還在不斷擴大，前人主要對當地葡萄霜霉病的病原、癥狀進行研究[13]，但對不同葡萄品種抵御霜霉病菌侵染的早期防衛反應鮮有系統報道。本研究測定了不同葡萄品種酶活性和SA、JA和H2O2含量與霜霉病發病程度的關系，旨在為葡萄霜霉病抗性育種研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 葡萄品種

無核紅寶石、蛇龍珠、玫瑰香，種植于煙臺市農業科學研究院同一試驗園中。

1.2 田間調查

于2016年8月15日即葡萄霜霉病的發病高峰期，對發病情況進行調查，每個品種調查4個小區，每小區選取10個新梢，病情調查采用6級記載法[14]。根據以下公式計算病情指數，通過計算病情指數分析不同葡萄品種對霜霉病的抗性。

病情指數=Σ（各級病葉數×相對級數值）調查總葉數×9×100endprint

1.3 室內離體葉片接種及抗性測定

取田間發病的新鮮葡萄病葉，培養新鮮的孢子囊[14]，配置孢子囊懸浮液濃度至2×105 個/mL 用于接種及以下試驗測定。

分別取無核紅寶石、玫瑰香、蛇龍珠新枝條健康無病的4—5節位葉片，采取葉盤法進行室內接種[14]。每葉盤滴加孢子囊懸浮液20 μL。

調查發病率，計算病情指數。

1.4 接種后酶活性測定

在田間選擇長勢一致的蛇龍珠、無核紅寶石，8株設一個小區，用手持噴壺噴霧葡萄植株4—6節位無病葉片，至葉片均勻布滿霧滴，噴霧溶液為2×105個/mL霜霉病菌孢子囊懸浮液，以清水為對照。重復4次。接種后每隔2 d取樣一次，測定葉片SOD、POD、CAT活性的變化，共取樣6次。

SOD活性、POD活性、CAT活性測定參照趙世杰等[18]的方法。

1.5 接種后葡萄葉片內源SA、H2O2、JA含量測定

使用配制的2×105個/mL霜霉病菌孢子囊懸浮液噴施蛇龍珠、無核紅寶石新梢，至葉片均勻布滿霧滴，用白色塑料袋保濕，不同時段取樣。重復4次。SA提取及測定參照劉玉良等[15]的方法，取不同品種葡萄新鮮葉片各0.4 g，分別提取游離態、結合態SA樣品，296 nm紫外光處測其吸光度。H2O2含量的測定參照郝再彬等[16]的方法。JA含量的測定參照蘇雷等[17]的方法。

1.6 噴施SA、H2O2、JA后葡萄霜霉病抗性測定

通過葉盤法，取無核紅寶石新枝條健康無病的4—5節位葉片，用打孔器打取直徑1 cm的葉盤，葉背面朝上放置于鋪有無菌濕潤濾紙的平皿中，每皿放置10個。500 μmol·L-1水楊酸、250 μmol·L-1茉莉酸及400 μmol·L-1過氧化氫，分別添加0.01%表面活性劑 Tween 20后用小噴壺噴施，至葉片均勻布滿霧滴，并用 Tween 20和水混合液處理作為對照。24 h后接種2×105個/mL霜霉病菌孢子囊懸浮液，7 d后調查結果。每處理重復4個。

2 結果與分析

2.1 不同品種葡萄對霜霉病的抗性

田間調查結果顯示，無核紅寶石、玫瑰香、蛇龍珠的霜霉病發病指數分別為52.32、39.26及19.81；室內接種試驗結果表明，三個品種葡萄霜霉病的病情指數則為67.41、49.28和43.21。綜合田間及室內結果得出，無核紅寶石對葡萄霜霉病較為感病，而蛇龍珠相對抗病，于是選取無核紅寶石及蛇龍珠開展后續試驗。

2.2 接種葡萄霜霉菌后葉片POD活性動態變化

由圖1可以看出，接種葡萄霜霉病菌影響葡萄POD活性，不同品種的POD活性在接種病原菌后與對照相比都有明顯升高，且不同抗性品種間差異顯著。蛇龍珠葡萄葉片內POD活性在處理后第2 d就顯著升高，到第4 d其活性達到最高，為8.6 U·min-1·g-1 FW，雖然從第6 d開始POD活性開始下降，但持續到第10 d，其活性依然高于對照，第12 d時與對照含量相當。感病品種無核紅寶石的POD活性變化曲線態勢與蛇龍珠趨于一致，但其活性在4～6 d期間顯著低于蛇龍珠，且從第10 d以后與對照相比沒有顯著差異。

2.3 接種葡萄霜霉菌后葉片CAT活性動態變化

不同葡萄品種接種霜霉病菌后葉片CAT活性的動態變化見圖2，接種后第2 d，蛇龍珠的CAT活性顯著增加，2～6 d持續升高，在第6 d時其活性達到最高，為46.9 U·min-1 ·g-1 FW，是對照的3.14倍，8～10 d雖然活性下降，但依然顯著高于對照，12 d與對照沒有顯著差異。與抗性品種相比，無核紅寶石的CAT活性略有升高，只有第4 d及第6 d時，其活性顯著高于對照，其他時間與對照沒有顯著差異。

2.4 接種葡萄霜霉菌后葉片SOD活性動態變化

與對照相比，接種霜霉菌后第2 d兩品種的SOD活性就開始顯著增強，皆在第4 d達到最高，后開始降低，但抗感品種沒有顯著差異，10～12 d抗病品種SOD活性顯著高于對照及感病品種（圖3）。

2.5 不同品種葡萄接種霜霉病菌后SA含量變化

由圖4可知，兩品種SA含量在未接種時沒有顯著差異，接種后都明顯升高。蛇龍珠在處理3 h后，SA水平迅速持續增加，12 h時其含量達到最高值800.32 ng·g-1 FW；感病品種無核紅寶石的SA含量于接種病原菌6 h達最大，但其不同時間含量都顯著低于蛇龍珠。顯然，接種霜霉病菌影響葡萄內源SA的生成，且不同品種間差異顯著，抗病品種較感病品種SA升高出現早、生成量更高。

2.6 不同品種葡萄接種霜霉病菌后JA含量變化

由圖5可見，未接種葡萄霜霉病菌時JA含量兩品種間沒有顯著差異，接種后均有所增加，在接種12 h時達到最大，而后降低，且品種間沒有顯著差異。

2.7 不同品種葡萄接種霜霉病菌后H2O2含量變化

由圖6可見，接種葡萄霜霉病菌前，蛇龍珠葉片內源H2O2含量為20.2 μmol·L-1 ，紅寶石為19.3 μmol·L-1 ，二者間無顯著差異。接種后，蛇龍珠在接種1 h時葉片中H2O2水平出現猝發現象，H2O2含量達最大，為27.80 μmol·L-1 ，在7 h時恢復到最初水平；無核紅寶石葉片H2O2含量在接種1 h時有所降低，而后增加，在接種3 h時達最大，為22.2 μmol·L-1 ，而后維持在最初水平。表明H2O2參與霜霉病菌侵染葡萄葉片過程。

2.8 噴施SA、H2O2、JA后葡萄的霜霉病抗性

由表2可知，對照發病率為100.00%，SA、H2O2、JA有助于增強葡萄對霜霉病的抗性，抗性增強分別為44.87%、28.21%和15.38%，說明SA增強抗性較為明顯，其次為H2O2，最弱為JA。endprint

3 討論與結論

病原侵染植物后會誘使植物體內次生代謝產物、植物抗菌蛋白等多種生理生化指標發生改變，從而誘導植物獲得抗病性。植物體內過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）是細胞抵御活性氧傷害的酶系統的主要成員[19-21]，SOD主要清除超氧陰離子（O·2）成H2O2；POD和CAT主要還原H2O2為H2O。史娟等[7]研究表明，葡萄品種間的抗性與POD、PPO、PAL、幾丁質酶活性存在一定相關性；但是呂秀蘭等[5]研究表明，PPO、PAL、CAT的活性與霜霉病病情指數呈極顯著負相關，SOD活性與霜霉病病情指數相關不顯著，與前面的研究結果相矛盾。本試驗結果表明葡萄品種間的抗病性與POD、CAT活性存在一定相關性，但SOD活性在品種間沒有顯著差異，與史娟及林玲[7，19]等的研究結果一致。因此，在葡萄對霜霉病的抗性反應中，POD和CAT對活性氧的清除可能作為一種功能事件參與到其中，POD和CAT活性可作為葡萄品種霜霉病抗性鑒定的輔助標準。SOD的酶活不能作為鑒定標準。

SA、H2O2、JA是參與植物防衛反應的重要信號分子[8，9]。關于SA、H2O2、JA參與葡萄對病原菌的防御反應已有報道[11，22]。SA介導的植物系統獲得抗性（SAR）信號傳導通路，病原物侵染后，植物SA含量上升，誘導NPR1對抗病防衛基因的活性[10]；低濃度H2O2作為信號物質通過影響葡萄葉片病程相關蛋白酶活性參與調控葡萄抵御霜霉病菌侵染，從而增強葡萄對霜霉病的抗性[11，22]；有研究表明茉莉酸類化合物具有廣泛的生理效應，不僅能夠調節植物的生長發育過程，而且也是非生物脅迫如紫外線、干旱與機械損傷等和生物脅迫如病蟲害等生理過程中的重要調控因子[12]。本研究在田間接種葡萄霜霉病菌條件的誘導下，檢測不同抗性品種葉片的SA、H2O2、JA含量的變化。結果表明，不同抗性品種的SA、H2O2含量在接種病原菌后與對照相比都有明顯升高，且不同品種間差異顯著，這與林志強等[11]的研究結果一致；JA在品種間沒有顯著差異，與林志強等[11]報道有所不同。筆者進一步測定了葡萄外源噴施SA、H2O2、JA后對葡萄霜霉病菌抗性的影響，SA增強抗性較為明顯，其次為H2O2，最弱為JA。因此，SA、H2O2參與了萄萄抵御霜霉病菌侵染的早期防衛反應。

參 考 文 獻：

[1] 李寶燕，王培松，王英姿. 葡萄霜霉病的生物藥劑防治[J]. 農藥，2014，53（11）： 853-855.

[2] 金恭璽，岳永亮，宋玉萍，等. 葡萄霜霉病初次侵染來源和初侵染的特點及防治[J]. 新疆農業科學，2015，52（6）： 1105-1111.

[3] 徐紅霞， 朱建蘭， 常永義. 葡萄品種對霜霉病抗性研究[J]. 中外葡萄與葡萄酒， 2004（2）： 30-31.

[4] 房玉林，宋士任，張艷芳，等. 不同品種葡萄抗霜霉病特性與葉片POD、PPO活性關系的研究[J]. 西北植物學報， 2007， 27 （2）： 392-395.

[5] 呂秀蘭，張光倫，龔榮高，等. 22個葡萄品種過氧化物同工酶研究[J]. 四川農業大學學報， 2005， 23（2）： 182-185.

[6] 喬寶營，黃海帆，劉崇懷，等. 幾種理化因素與葡萄霜霉病抗性的關系[J]. 果樹學報， 2014， 31（5）： 901-905.

[7] 史娟，馮美，邱豐，等.葡萄感染霜霉病葉片中一些酶活性的變化[J].寧夏農學院學報，2002，23（1）： 17-19.

[8] Dong X.SA， JA， ethylene， and disease resistance in plants[J]. Current Opinion in Plant Biology， 1998， 1（4）： 316-323.

[9] Wu G， Shortt b J， Lawrence E B， et al. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H2O2-generating glucose oxidase in transgenic potato plants[J].Plant Cell， 1995， 7（9）： 1357-1368.

[10]Ryals J A， Neuenschwander U H， Willits M G， et al. Systemic acquired resistance[J]. Plant Cell， 1996， 8： 1809-1819.

[11]林志強，郭秀萍，車永梅，等. NO和H2O2提高葡萄抗霜霉病的生理作用機制[J]. 植物病理學報， 2011， 41（6）：576-586.

[12]朱家紅，彭世清. 茉莉酸及其信號傳導研究進展[J]. 西北植物學報，2006， 26（10）：2166-2172.

[13]王英姿， 任強， 欒炳輝，等. 葡萄霜霉病菌田間消長動態及藥劑防治試驗[J]. 中國果樹，2007（6）： 34-35.

[14]李寶燕， 王英姿， 劉學卿，等. 3種殺菌劑對葡萄霜霉病菌的毒力測定和田間藥效試驗[J]. 江蘇農業科學， 2014， 42（1）： 98-99.

[15]劉玉良，米富貴，特木爾布和，等. 苜蓿葉片水楊酸含量與其薊馬抗性的關系[J].西北植物學報， 2011， 31（3）：588-594.

[16]郝再彬，蒼晶，徐仲. 植物生理實驗技[M].哈爾濱：哈爾濱工業大學出版社，2002： 198-199.

[17]蘇雷，李婭，王程輝. 高效液相色譜-質譜聯用法測定煙草中茉莉酸[J].分析科學學報， 2013，29（2）：253-256.

[18]趙世杰，史國安，董新純. 植物生理學實驗指導[M].北京：中國農業科學技術出版社，2002.

[19]林玲，盧江，黃羽，等. 不同葡萄品種感染霜霉病菌后葉片中幾種酶活性的變化[J].南方農業學報，2014，45（2）：222-225.

[20]曾永三，王振中. 苯丙氨酸解氨酶和過氧化氫酶活性與豇豆抗銹病性的關系[J]. 仲愷農業技術學院學報，2003，16（1）：1-5.

[21]周曉惠，Wolukau J N，李英，等. 甜瓜蔓枯病抗性與 SOD、CAT 和 POD 活性關系的變化[J]. 中國瓜菜，2007（2）：4-6.

[22]李寶燕，王培松，倪壽山，等. 不同葡萄品種對霜霉病的抗性鑒定及相關生理生化研究[J]. 果樹學報，2016，33（2）：217-223.endprint