銀杏蜜環(huán)口服溶液減輕腦缺血再灌注大鼠腦梗死的實驗研究

宋文婷 劉建勛 姚明江 王光蕊 王益民 王 勇 徐 立

(1 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，中藥藥理北京市重點實驗室，北京，100091； 2 西安步長中醫(yī)心腦病醫(yī)院，西安，710082)

銀杏蜜環(huán)口服溶液由銀杏葉提取物、天麻蜜環(huán)菌粉組成。其主要組分銀杏葉提取物可改善腦部及周邊血液循環(huán)，天麻蜜環(huán)菌可鎮(zhèn)靜安神。銀杏蜜環(huán)口服溶液上市后，廣泛用于缺血性腦血管疾病、慢性腦低灌注、老年性高血壓等腦部疾病，可改善血壓、血流和腦缺血癥狀[1-5]；也廣泛應(yīng)用于心絞痛的臨床治療[6-7]，可改善心肌缺血的癥狀。

本課題組前期實驗研究證明銀杏蜜環(huán)口服溶液可保護缺氧復(fù)氧的血管內(nèi)皮細胞，其保護作用可能是通過作用p38 MAPK調(diào)節(jié)eNOS/NO信號途徑實現(xiàn)的[8]。然而銀杏蜜環(huán)口服溶液對于實驗動物腦梗死的保護作用尚未見報道。故本研究采用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，研究銀杏蜜環(huán)口服溶液的腦保護及抗氧化作用，并比較其全方和主要組分的藥效，探討組分間的協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD種大鼠，雄性，220～240 g，由維通利華(北京)實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001。合格證號：11400700161146。

1.1.2 藥物 1)銀杏蜜環(huán)口服溶液(邛崍?zhí)煦y制藥有限公司生產(chǎn)，批號：160312)；2)銀杏葉提取物(邛崍?zhí)煦y制藥有限公司生產(chǎn)，批號：160402)；3)天麻蜜環(huán)菌粉(邛崍?zhí)煦y制藥有限公司生產(chǎn)，批號：20151027)；4)金納多(銀杏葉提取物片，德國威瑪舒培博士藥廠生產(chǎn)，批號：5260613)；5)天麻蜜環(huán)菌片(江蘇神華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：20160602)

1.1.3 試劑與儀器 氯化-2,3,5-三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，用0.2 mol/L PBS(pH 7.2)配成1.2%濃度，低溫避光保存；水合氯醛(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20131027)；SOD、GSH-PX、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所提供，批號分別為：20161216，20161216，20161217)，尼龍栓線(北京西濃科技有限公司2432-100型)。多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)，國產(chǎn)MPIAS-500型。超聲破碎儀，美國SONICS VCX150PB型。超速離心機，日本HITACHI 55P-72型。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 動物隨機分配入各組中：假手術(shù)組，模型組，金納多18 mg/kg組，銀杏葉提取物(銀提)9 mg/kg組，天麻蜜環(huán)菌素片(蜜環(huán)菌片)600 mg/kg組，天麻蜜環(huán)菌粉(蜜環(huán)菌粉)300 mg/kg組，銀杏蜜環(huán)口服溶液618 mg/kg(銀蜜高劑量)組，銀杏蜜環(huán)口服溶液309 mg/kg(銀蜜低劑量)組，共8組，每組10只。用4%水合氯醛麻醉大鼠(1 mL/100 g)，以恒溫電熱毯將動物體溫維持在37 ℃，動物仰臥位固定，沿頸部中線切開皮膚及皮下組織，分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)及頸外動脈(ECA)，結(jié)扎ECA與CCA，夾閉ICA遠心端，于ECA與ICA分叉處作一“V”字形切口，插入直徑為0.24 mm的尼龍線栓，松開動脈夾，繼續(xù)插入尼龍線至稍有阻力后略回撤，線栓插入深度為(20±2)mm左右，尼龍線外留約1 cm，縫合頸部切口，插線的末端固定于切口外。1.5 h后輕輕提拉線頭至略有阻力，表明線的頭端已抽出頸內(nèi)動脈，實現(xiàn)再灌注，剪斷插線皮外段。模型成功的標(biāo)志：動物麻醉清醒后出現(xiàn)缺血側(cè)Horner′s征及對側(cè)以前肢為主的偏癱，無此癥狀的棄去不用，其余回籠飼養(yǎng)，并保持體溫。

1.2.2 給藥方法 在插入線栓(缺血)后經(jīng)十二指腸給予各受試藥物。除銀杏蜜環(huán)口服溶液618 mg/kg組外，各給藥組均按3 mL/kg體積給予受試藥物，假手術(shù)和模型組按3 mL/kg體積給予生理鹽水。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 神經(jīng)行為學(xué)評分 采用單盲法觀察大鼠神經(jīng)行為學(xué)，以Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)[9]：無神經(jīng)損傷癥狀，0分；不能完全伸展左側(cè)前爪，1分；向非缺血側(cè)轉(zhuǎn)圈，2分；行走時向非缺血側(cè)傾倒，3分；不能自發(fā)行走，意識昏迷，4分。于缺血后6 h、24 h各進行1次評分。

1.2.3.2 腦梗死范圍 動物進行末次神經(jīng)行為評分后，稱體質(zhì)量，以4%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，離心分離血清-80 ℃凍存；隨后迅速斷頭取腦，置于冰浴臺上，從前往后作冠狀位切片，平均切成5個腦片(第四腦片先切0.5 mm薄片液氮凍存)，將大腦切片浸泡于1.2%TTC磷酸緩沖液中，37 ℃恒溫避光孵育約10 min，正常腦組織染為玫瑰紅色，腦梗死區(qū)不染色(白色)，將腦片浸泡于10%福爾馬林溶液中固定4 h。福爾馬林固定的腦片按腦的前后順序整齊排列，經(jīng)攝像頭采樣(固定采樣高度)，用多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)計算大鼠全腦面積及腦梗死面積，以梗死面積/全腦面積表示腦梗死范圍。

1.2.3.3 血清SOD、GSH-PX活力以及MDA水平檢測 按照說明書進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 對腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦梗死范圍、神經(jīng)行為學(xué)的影響 缺血再灌注24 h，模型組大鼠術(shù)側(cè)局部缺血嚴重，形成明顯的梗死灶。與模型組比較，金納多組、銀杏葉提取物組及銀杏蜜環(huán)口服溶液309 mg/kg和618 mg/kg劑量組腦梗死范圍均顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。缺血后6 h，模型組動物可見明顯的神經(jīng)功能損傷，主要表現(xiàn)為左肩內(nèi)收、屈曲，前肢無力，向非缺血側(cè)轉(zhuǎn)圈，行走時向非缺血側(cè)傾倒等。與模型組比較，所有給藥組均未表現(xiàn)出明顯的改善神經(jīng)癥狀的作用。缺血后24 h，與模型組比較，金納多組、銀杏葉提取物組、天麻蜜環(huán)菌片組及銀杏蜜環(huán)口服溶液309 mg/kg和618 mg/kg劑量組均有明顯改善神經(jīng)癥狀的作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1，圖1～2。

圖1 銀杏蜜環(huán)口服溶液對MCAO大鼠腦梗死范圍的影響

注：與假手術(shù)組(正常對照組)比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與金納多組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與銀杏葉提取物比較，□P<0.05，□□P<0.01；與天麻蜜環(huán)菌片比較，■P<0.05，■■P<0.01；與天麻蜜環(huán)菌粉比較，#P<0.05，##P<0.01

圖2 銀杏蜜環(huán)口服溶液對MCAO大鼠行為學(xué)的影響

注：與假手術(shù)組(正常對照組)比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與金納多組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與銀杏葉提取物比較，□P<0.05，□□P<0.01；與天麻蜜環(huán)菌片比較，■P<0.05，■■P<0.01；與天麻蜜環(huán)菌粉比較，#P<0.05，##P<0.01

圖3 銀杏蜜環(huán)口服溶液對MCAO大鼠SOD活力的影響

注：與假手術(shù)組(正常對照組)比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與金納多組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與銀杏葉提取物比較，□P<0.05，□□P<0.01；與天麻蜜環(huán)菌片比較，■P<0.05，■■P<0.01；與天麻蜜環(huán)菌粉比較，#P<0.05，##P<0.01

圖4 銀杏蜜環(huán)口服溶液對MCAO大鼠 MDA水平的影響

注：與假手術(shù)組(正常對照組)比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與金納多組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與銀杏葉提取物比較，□P<0.05，□□P<0.01；與天麻蜜環(huán)菌片比較，■P<0.05，■■P<0.01；與天麻蜜環(huán)菌粉比較，#P<0.05，##P<0.01

圖5 銀杏蜜環(huán)口服溶液對MCAO大鼠血清GSH-PX的影響

注：與假手術(shù)組(正常對照組)比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與金納多組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與銀杏葉提取物比較，□P<0.05，□□P<0.01；與天麻蜜環(huán)菌片比較，■P<0.05，■■P<0.01；與天麻蜜環(huán)菌粉比較，#P<0.05，##P<0.01

表1 對MCAO大鼠腦梗死范圍及神經(jīng)行為學(xué)影響

注：與假手術(shù)組(正常對照組)比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與金納多組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與銀杏葉提取物比較，□P<0.05，□□P<0.01；與天麻蜜環(huán)菌片比較，■P<0.05，■■P<0.01；與天麻蜜環(huán)菌粉比較，#P<0.05，##P<0.01

表2 對MCAO大鼠血清SOD、MDA、GSH-PX的影響

注：與假手術(shù)組(正常對照組)比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與金納多組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與銀杏葉提取物比較，□P<0.05，□□P<0.01；與天麻蜜環(huán)菌片比較，■P<0.05，■■P<0.01；與天麻蜜環(huán)菌粉比較，#P<0.05，##P<0.01

2.2 對血清SOD、MDA、GSH-PX的影響 缺血再灌注后，模型組SOD及GSH-Px活力下降，MDA水平升高，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05～0.01)；給藥后對照藥金納多18 mg/kg組大鼠血清SOD和GSH-Px活力增加，MDA水平下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05～0.01)；銀杏葉提取物9 mg/kg組及天麻蜜環(huán)菌片600 mg/kg組，作用較弱，上述指標(biāo)均有改善趨勢，但僅見GSH-Px活力顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，天麻蜜環(huán)菌粉300 mg/kg組GSH-PX活力顯著增加，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05～0.01)；銀杏蜜環(huán)口服溶液可以增加SOD和GSH-Px活力，降低MDA水平，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05～0.01)。見表2，圖3～5。

3 討論

腦梗死發(fā)生后，腦血流量中斷，引起腦組織缺氧，缺氧及氧化應(yīng)激是腦梗死病理級聯(lián)反應(yīng)中的重要環(huán)節(jié)。在缺血性神經(jīng)元損傷過程中，氧化自由基可引發(fā)脂質(zhì)過氧化瀑布效應(yīng)，蛋白質(zhì)變性失活，膜屏障功能受到嚴重影響，從而導(dǎo)致細胞死亡。氧自由基及其引起的脂質(zhì)過氧化是缺血再灌注損傷的重要機制之一[10-11]。腦缺血時，由于三磷腺苷(ATP)生成減少，細胞色素氧化期間產(chǎn)生大量自由基，包括O2-，HO2-，OH-，H2O2等。自由基可廣泛攻擊富含不飽和脂肪酸的神經(jīng)膜與血管，引發(fā)脂質(zhì)過氧化瀑布效應(yīng)，蛋白質(zhì)變性失活，膜屏障功能受到嚴重影響，從而導(dǎo)致細胞死亡。氧自由基及其引起的脂質(zhì)過氧化是缺血再灌注損傷的重要機制之一。MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，可間接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度。自由基清除劑SOD等可在缺血后誘導(dǎo)產(chǎn)生。SOD活性的高低反映體內(nèi)清除氧自由基的能力。GSH-Px的主要作用是清除脂類氫過氧化物和H2O2，保護生物膜及生物大分子免受自由基的損害?？寡趸瘧?yīng)激作用是中藥發(fā)揮治療腦梗死藥效的重要途徑。試驗結(jié)果表明，銀杏蜜環(huán)口服溶液可顯著縮小大鼠腦梗死范圍；改善缺血大鼠24 h神經(jīng)癥狀可顯著，增強血清SOD及GSH-Px活力，降低MDA水平，說明其抗氧化作用是其治療腦梗死的重要機制之一。

同時試驗還觀察到，與銀杏葉提取物比較，銀杏蜜環(huán)口服溶液618 mg/kg組SOD活力顯著強于18 mg/kg及9 mg/kg組，與天麻蜜環(huán)菌比較，銀杏蜜環(huán)口服溶液618 mg/kg組梗死范圍明顯小于600 mg/kg組，SOD活力顯著強于600 mg/kg和300 mg/kg組，MDA顯著低于600 mg/kg和300 mg/kg組，GSH-Px活性顯著高于300 mg/kg組。

與銀杏葉提取物比較，銀杏蜜環(huán)口服溶液309 mg/kg組SOD活力顯著高于9 mg/kg組；與天麻蜜環(huán)菌比較，銀杏蜜環(huán)口服溶液309 mg/kg組SOD活力顯著高于600 mg/kg和組，GSH-Px活性顯著高于300 mg/kg組。

銀杏蜜環(huán)口服溶液的主要組分包括銀杏葉提取物和天麻蜜環(huán)菌，既往文獻表明銀杏葉提取物和天麻蜜環(huán)菌均具有一定的抗氧化作用[12-15]。本研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物和天麻蜜環(huán)菌均具有不同程度的抗氧化作用，而銀杏蜜環(huán)口服溶液組在治療腦梗死藥效和抗氧化作用方面均顯著優(yōu)于相同劑量下的銀杏葉提取物組和天麻蜜環(huán)菌組，表明銀杏蜜環(huán)口服溶液對腦梗死大鼠的抗氧化作用優(yōu)于單一組分，2種組分間具有協(xié)同增效作用，還需進一步進行配伍研究。

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