結扎頸總動脈復合低氧致C 57 BL/6小鼠缺血缺氧性腦病模型的建立及溶栓膠囊的作用

徐 立 宋文婷 任建勛 王光蕊 朱 盛 姚明江 侯金才 劉建勛

(中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所,中藥藥理北京市重點實驗室,北京,100091)

缺血缺氧性腦病(Hypoxic-ischemic Encephalopathy,HIE)是指各種圍產期因素引起部分或完全缺氧和腦血流減少或暫停而導致胎兒及新生兒的中樞神經損傷[1]。表現為運動障礙及姿勢異常,常伴發智力低下、語言障礙等。該病發病率高,在住院新生兒中僅次于新生兒黃疸和新生兒肺炎,居于第3位,其導致的嬰幼兒殘障給家庭帶來痛苦,給社會帶來經濟負擔。目前國內外對HIE相關動物模型的研究鮮見系統報道。本研究探索性建立小鼠缺氧缺血恢復期模型,觀察該模型小鼠在抓力、學習記憶能力、腦組織病理形態以及相關蛋白的表達等方面的變化,探討與小兒腦癱相關的動物模型以及藥物治療的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 C 57 BL/6小鼠,雄性,18～22 g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2009-0007,合格證號:0234931。

1.1.2 藥物 溶栓膠囊,0.25 g/粒,山西中遠威藥業有限公司生產,實驗用其不含賦形劑的中間產品,批號20110503;異氟烷(吸入麻醉劑),山東科源制藥有限公司生產,批號:1012018。

1.1.3 試劑與儀器 二元氣,8%氧氣和92%氮氣,北京千禧京城氣體銷售中心提供。TB-718生物組織自動包埋機,TP10202徠卡全自動組織脫水機,Leica組織切片機,Nikon顯微鏡。小鼠抓力測定儀(YLS-113A),濟南益延科技發展有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 腦缺氧缺血恢復期模型的建立，根據文獻[2-3]給C 57 BL/6小鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉,頸部正中切口,分開肌肉層,暴露右側頸總動脈,穿絲線結扎,隨即縫合傷口,放入200 mm×150 mm×150 mm的容器中,通入8%氧氣和92%氮氣15 min后放回鼠盒中飼養。假手術組(10只)只切開皮膚后縫合,不結扎頸總動脈及置缺氧環境。第2天觀察動物行為學,輕提鼠尾,以左肩內收,身體旋轉為模型成功,否則棄去不用。將模型成功小鼠隨機分組(每組10只),模型組,溶栓膠囊400、200、100 mg/kg劑量組。

1.2.2 給藥方法 手術后24 h開設灌胃給藥,體積為20 mL/kg,1次/d,連續給藥4周。假手術組和模型組給予等體積生理鹽水。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 小鼠抓力測定 給藥4周后,采用抓力測定儀測定動物的抓力。將動物輕輕放在抓力板上,抓住鼠尾輕輕向后牽拉,待小鼠抓牢抓力板后,均勻用力向后拉,致使動物松爪,儀器自動記錄小鼠的最大抓力,重復測定3次,取均值。

1.2.3.2 MORRIS水迷宮測定 水池中放入牛奶,充分混勻至水呈乳色,使小鼠無法通過視覺辨認平臺位置。正式試驗前,小鼠訓練1次/d,連續訓練4 d。訓練及正式試驗期間,迷宮外參照物保持不變。訓練日將小鼠面向池壁放入水中,訓練其找到平臺。訓練時間180 s。180 s內未找到平臺者,將其引至平臺,使之站立臺上30 s,產生記憶。第5天正式試驗,自動錄像記錄系統記錄小鼠180 s內找到平臺的時間(游泳持續時間)、游泳路徑長度,同時確定搜索策略等指標。

1.2.3.3 腦組織鏡下觀察 給藥4周后,麻醉動物并打開胸腔,經升主動脈段快速灌注4 ℃生理鹽水,直至剪開的肝臟流出液清亮為止;用4%的多聚甲醛灌注固定,斷頭取腦,將大腦組織置于4%的甲醛溶液中固定,24 h后進行脫水、透明、常規石蠟包埋,制成5 μm厚切片。將石蠟切片HE染色,光學顯微鏡觀察皮層神經元組織形態學變化并拍照。

1.2.3.4 腦組織免疫組化方法 采用PV-6000二步法免疫組化法。每組取6只動物切片,隨機取3個視野,取其平均值。將采集的圖像應用Image-pro Plus 5.1分析系統進行分析,所得數據作免疫組織化學染色陽性信號累積光密度(IOD),以IOD值作為組織表達的定量標準。累積光密度(IOD)=平均光密度(AHD)×陽性面積(A)。

2 結果

2.1 對HIE小鼠動物抓力的影響 給藥4周后,模型組小鼠的抓力下降,與假手術組比較差異均有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較,溶栓膠囊3個劑量組小鼠抓力均顯著增加(P<0.05)。見表1。

2.2 對HIE小鼠學習記憶能力的影響 造模4周后,模型組小鼠學習記憶能力明顯降低,與假手術組比較,尋找水迷宮平臺時間以及路徑長度均明顯延長(P<0.05～0.01)。給藥4周后,與模型組比較,溶栓膠囊200、400 mg生藥/kg組小鼠尋找水迷宮平臺的時間以及路徑長度均明顯縮短(P<0.05),溶栓膠囊100 mg生藥/kg組小鼠尋找平臺時間及路徑長度均無明顯改變。見表1。

表1 對HIE小鼠抓力和學習記憶能力的影響

注:與假手術組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.3 腦組織病理形態變化 腦組織HE染色可見假手術組皮層為正常神經元組織結構;模型組動物神經元細胞排列紊亂,大量變性、壞死及凋亡細胞,另見大片軟化灶;在溶栓膠囊大劑量組(400 mg/kg)中,神經元細胞排列較整齊,細胞變性程度減輕,見少量壞死區域;但仍有小膠質細胞增生,血管擴張充血,炎性反應細胞浸潤。見圖1。

圖1 HIE C 57 BL/6小鼠神經元病理形態 (HE染色,×400)

注：A假手術組;B模型組;C溶栓膠囊400 mg生藥/kg組

2.4 對HIE小鼠腦組織NSE、MAP-2以及Caspase-3表達的影響 免疫組化結果表明,模型組小鼠腦組織NSE和MAP-2呈低表達,與假手術組比較差異均有統計學意義(P<0.01),Caspase-3呈高表達,與假手術組比較差異均有統計學意義(P<0.01);溶栓膠囊3個劑量組小鼠腦組織NSE和MAP-2表達均高于模型組(P<0.01),Caspase-3表達均低于模型組(P<0.01)。見表2、圖2。

表2 對HIE小鼠腦組織NSE、MAP-2及Caspase-3 表達的影響

注:與假手術組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01

3 討論

腦組織的能量來源幾乎全部是有氧糖代謝,而腦內的糖原又很少,腦代謝所需要的葡萄糖和氧全靠腦部充分的血液循環供應。因此在缺氧、腦血流減少或暫停條件下必然導致腦組織的損傷,從而長期影響肢體功能和智力水平。研究認為腦血流量不能滿足腦組織的氧需求是新生兒腦損傷的一個主要病理因素[3]。有研究顯示,C 57 BL/6小鼠對腦缺血性損傷具有一定的敏感性,特別是在CA1區域[4]。

圖2 溶栓膠囊對HIE模型小鼠神經元NSE、MAP-2 及Caspase-3表達的影響(HE染色,×400)

注：A假手術組;B模型組;C溶栓膠囊400 mg生藥/kg組

HIE臨床上視缺血缺氧持續時間和程度決定小兒意識、肌張力、反射、驚厥、病程和預后的程度,中度和重度缺血缺氧患兒均可表現為肌張力減弱或松軟,預后較差[5],且這個過程是不可逆的,可能導致患兒永久性的智力低下、腦性癱瘓[6]。神經元特異性烯醇化酶(NSE)是糖酵解途徑的關鍵酶,是特異性定位在神經元和神經內分泌細胞胞質內的可溶性蛋白質,占腦內可溶性蛋白質的1.5%。文獻報道,當神經元壞死時,該酶外漏釋放于腦脊液;同時由于血腦屏障的開放,因此血清神經元特異性烯醇化酶可升高[7-8]。目前血清或腦脊液中NSE不僅是判斷HIE的一個重要檢測指標之一,而且可用于判斷HIE的輕中重程度以及預后[9-10]。微管相關蛋白2(MAP-2)主要在神經元胞體和樹突表達,是神經元樹突靜態結構蛋白與細胞內肌動蛋白、神經絲和線粒體共同維持神經結構。在神經發育、分化和可塑性方面起作用,對生長因子、神經遞質、合成活動和神經毒性起關鍵作用[11]。因此MAP-2被認為是神經生長和修復相關蛋白,是研究神經再塑的分子標志物。它在腦缺血損傷中呈現出敏銳的敏感性,缺血3 min即可表現為表達缺失。Caspase-3屬于白介素1β轉換酶家族,是涉及細胞凋亡的蛋白酶。它參與了腦缺血后神經元損傷的病理過程,在腦缺血中起重要作用[12]。Caspase-3介導蛋白酶水解級聯過程。當體外培養的神經元被剝奪血清和處于去極化水平的K+存在的情況下,神經元出現活性C-JUN暫時性增加、線粒體膜電位喪失,Caspase-3蛋白酶激活和出現核凝集、核碎片,最后神經元死亡[13]。

本研究從腦缺血缺氧的病理角度出發,采用頸總動脈結扎復合通入氧氮二元氣的方法建立C 57 BL/6小鼠HIE模型,并飼養4周,檢測HIE小鼠恢復期的相關指標。研究發現,C 57 BL/6小鼠在此復合方法的誘導下出現病理性損傷,表現為小鼠肌力下降和學習記憶能力障礙,病理形態顯示神經元損傷,NSE和MAP-2低表達,Caspase-3高表達,證實該模型的檢查指標與臨床基本符合,制備模型的方法成立。

溶栓膠囊由地龍等提取而成,其功能為清熱定驚,活血通絡[14]。文獻報道該藥可改善缺血引起的組織損傷,促進其梗死病灶的修復[15],并能增加腦內血流量和減少其血管阻力[16],改善微循環,對小兒腦癱癥狀有明顯療效[17],證實其有改善患兒運動能力,語言能力,生活自理能力,溝通能力以及社交能力,同時促進患兒腦部發育,提高其智力水平的作用[18]。本研究灌胃給藥4周,觀察到溶栓膠囊可明顯改善肌力喪失及學習記憶能力障礙,保護HIE小鼠神經損傷,其機制可能與增加腦缺血缺氧耐受和腦儲備能力有關。

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