銀杏蜜環口服溶液對缺氧缺糖再灌注誘導腦微血管內皮細胞和SH-SY5Y細胞炎性損傷的保護作用與機制

鄭詠秋 張業昊 劉建勛 徐 立 李 磊 王益民 王 勇 王光蕊

(1 中國中醫科學院西苑醫院,基礎醫學研究所,北京，100091; 2 西安步長中醫心腦病醫院,西安,710082)

銀杏蜜環口服溶液的組為銀杏葉提取物和蜜環菌提取物。其主要作用為:擴張冠狀動脈和腦血管,增加冠脈血液流量或者腦部血液流量,同時改善局部微循環及細胞能量代謝,從而起到防止心腦血管的目的[1-2]。在前期本研究團隊對腦缺血/再灌注自噬信號通路調控的病理機制研究基礎上[3-4],本研究探討了銀杏蜜環口服溶液體外對缺氧缺糖再灌注誘導腦微血管內皮細胞和神經膠質瘤細胞損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 大鼠腦微血管內皮細胞及專用培養液購自Procell公司;SH-SY5Y細胞來自中科院上海細胞庫,DEME培養基和胎牛血清購自Gibco公司。

1.1.2 藥物 銀杏蜜環口服溶液,10 mL/支,批號:160312;銀杏葉提取物溶液,10 mL/支,含3 mg銀杏葉提取物/ mL和含0.1 g蜜環粉/mL,含3 mg銀杏葉提取物/mL;蜜環菌溶液,10 mL/支,含0.1 g蜜環粉/ mL;以上均由邛崍天銀制藥有限公司提供。研究試驗中涉及銀杏蜜環口服溶液加樣高、中、低劑量分別為50、25、15 μL/mL,折算成含藥劑量分別為5.15 mg/mL、2.575 mg/mL、和1.545 mg/mL。同理,蜜環菌溶液,劑量2.5 mg/mL;銀杏葉提取物溶液,劑量0.075 mg/mL。

1.1.3 試劑與儀器 HRP標記的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG購自YUARIO公司;兔抗磷酸化(GR95280-7)和非磷酸化eNOs多克隆抗體、兔抗Caspase3、Beclin-1、LC3I/II抗體購自Abcam公司,兔抗GAPDH抗體購自Sigma-Aldrich公司。IL-1β酶聯免疫吸附測定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒,NEOBIOSCIENCE產品,IL-6 ELISA試劑盒,NEOBIOSCIENCE產品,TNFa ELISA試劑盒,MyBioSource產品。氟化聚偏乙烯(PVDF)微孔轉移膜購自Millipore公司。超敏感底物發光試劑盒(SuperSignal West Femto kit),購自Pierce公司。Annexin V/PI雙標流式檢測試劑盒購自Beyotime InC。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 腦微血管內皮細胞培養于含有10%胎牛血清,青、鏈霉素各100 μ/mL的Procell腦微血管內皮細胞專用培養基,置37 ℃飽和濕度含5% CO2和95%空氣的恒溫箱中培養,0.25%胰蛋白酶消化傳代。選取對數生長期細胞進行實驗。SH-SY5Y細胞培養于含有10%胎牛血清,青、鏈霉素各100 μ/mL的高糖DMEM 培養基,置37 ℃飽和濕度含5% CO2和95%空氣的恒溫箱中培養,0.25%胰蛋白酶消化傳代。選取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 細胞缺氧缺糖(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)再灌注損傷模型的建立 細胞以每孔1×106個的濃度接種于直徑35 mm小皿,貼壁24 h后,細胞以無糖Earles平衡鹽溶液[無糖OGD液(g/L):NaCl 6.8,KCl 0.4,CaCl2·2H2O 0.264,MgSO4·7H2O 0.2,NaH2PO4·2H2O 0.156,NaHCO32.2]洗滌2次,換成無糖OGD培養液,將細胞置于改良密閉OGD罐內,通以95%N2-5%CO2氣體,通氣30 min后,置于37 ℃培養箱內繼續培養。

腦微血管內皮細胞6 h氧糖剝離后,更換成無血清DMEM培養基再灌注。正常對照采用有糖OGD液(g/L):NaCl 6.8,KCl 0.4,CaCl2·2H2O 0.264,MgSO4·7H2O 0.2,NaH2PO4·2H2O 0.156,NaHCO32.2,葡萄糖1.0培養。SH-SY5Y細胞經4 h氧糖剝離后,更換成無血清DMEM培養基再灌注。正常對照采用有糖OGD液(g/L):NaCl 6.8,KCl 0.4,CaCl2·2H2O 0.264,MgSO4·7H2O 0.2,NaH2PO4·2H2O 0.156,NaHCO32.2,葡萄糖1.0培養。

1.2.3 實驗分組及處理 實驗分為正常細胞對照組、模型組、各給藥組。1)正常對照組:實驗時吸出正常培養基,加入正常無血清培養基。2)模型組:吸出正常培養基,加入無血清培養基。3)給藥組(不同劑量):模型組分別加入終濃度為5.15 mg/mL(100 μL銀杏蜜環口服溶液+1.9 mL無血清培養基)、2.575 mg/mL(50 μL銀杏蜜環口服溶液+1.95 mL無血清培養基)和1.545 mg/mL(25 μL銀杏蜜環口服溶液+1.975 mL無血清培養基)的銀杏蜜環口服溶液、0.075 mg/mL的銀杏提取物(50 μL銀杏提取物溶液+1.95 mL無血清培養基)和2.5 mg/mL的蜜環提取物(50 μL蜜環菌溶液+1.95 mL無血清培養基)。6 h糖氧剝離后加入藥品作用,并立即復糖復氧培養并在24 h后收集活細胞進行凋亡的含量測定。

1.2.4 ELISA法測定細胞上清液IL-1β、TNF-α和IL-6的含量 本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗IL-1β、TNF-α和IL-6單抗包被于酶標板上,標準品和樣品中的IL-1β、TNF-α和IL-6與單抗結合,加入生物素化的抗體,形成免疫復合物連接在板上,辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合,加入酶底物TMB,出現藍色,加終止液硫酸,顏色變黃,在450 nm處測OD值,細胞因子濃度與OD值成正比,可通過繪制標準曲線求出標本中細胞因子濃度。

1.2.5 Western-blot法檢測eNOS磷酸化和自噬蛋白表達 采用蛋白裂解液提取胞質蛋白組織于4 ℃,3 000 r/min離心4 min,收集上清,進行Western Blot檢測。BCA法測定蛋白含量并定濃度至0.5 mg protein/mL,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),采用相關抗體進行磷酸化和非磷酸化相關蛋白表達檢測。增強化學發光(Enhanced Chemiluminescence,ECL)顯色。底片曝光。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集細胞,每樣品配制成5×105/mL懸液,離心去上清,加入195 μL AnnexinV-FITC結合液重懸細胞,加入10 μL PI染色液和5 μL FITC-conjugated Annexin-V進行雙重染色20 min。然后在Epic XL流式細胞儀上在488 nm處檢測,應用Expo32軟件分析數據。

1.3 統計學方法 所有OD值都應減除空白值后再行計算。以標準品1 000、500、250、100、50、25 pg/mL之OD值在半對數紙上作圖,畫出標準曲線。將濃度作為X軸(對數軸),OD值作為Y軸(線性軸)。曲線應為一光滑曲線。根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應細胞因子含量。實驗結果以平均值±標準差表示,數據組件比較采用方差檢驗,Western Blot圖像分析結果采用SPSS軟件(Version 11.0)進行非參數檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 銀杏蜜環口服溶液對缺氧缺糖/復氧復糖誘導腦微血管內皮細胞上清液炎性反應因子含量的影響 腦微血管內皮細胞在6 h的缺糖缺氧損傷和24 h的再灌注后與對照組比較,其上清液IL-1β、TNF-α和IL-6含量明顯升高(P<0.05);分別給予5.15 mg/mL、2.575 mg/mL、和1.545 mg/mL的銀杏蜜環口服溶液、0.075 mg/mL的銀杏提取物和的2.5 mg/mL蜜環提取物后,發現銀杏蜜環口服溶液高、中、低3個劑量組、銀杏提取物0.075 mg/mL和蜜環提取物2.5 mg/mL均可抑制上清液TNF-α、IL-1β和IL-6含量,其中銀杏蜜環口服溶液中劑量(2.575 mg/mL)對IL-1β和IL-6含量的抑制明顯優于銀杏提取物(0.075 mg/mL)和蜜環提取物(2.5 mg/mL)。比較之下,銀杏蜜環口服溶液大、低劑量組(5.15 mg/mL、1.545 mg/mL)作用較弱,所以在接下來的試驗中,將銀杏蜜環劑量定為2.575 mg/mL、1.545 mg/mL 2個劑量。見表1。

2.2 銀杏蜜環口服溶液對缺氧缺糖/復氧復糖誘導腦微血管內皮細胞自噬信號通路活化的影響 6 h的缺糖缺氧損傷和24 h的再灌注可引起腦微血管內皮細胞凋亡蛋白Caspase3和自噬蛋白Beclin-1表達升高,銀杏蜜環口服溶液(1.545、2.575 mg/mL)可明顯抑制Caspase3和Beclin-1表達,同時銀杏提取物也可抑制Beclin-1表達。模型組eNOS磷酸化水平降低,LC3II/LC3I水平升高,但無統計學意義,其中銀杏蜜環口服溶液(1.545、2.575 mg/mL)和其有效組分銀杏提取物、蜜環提取物均可明顯抑制LC3II/LC3I,銀杏蜜環口服溶液(2.575 mg/mL)還可有效提升eNOS磷酸化水平。可見銀杏蜜環口服溶液療效要優于其有效組分銀杏提取物、蜜環提取物。見圖1～5。

2.3 銀杏蜜環口服溶液對缺氧缺糖/復氧復糖誘導SH-SY5Y細胞凋亡的影響 模型組分別加入終濃度為25 μL/mL、15 μL/mL的銀杏蜜環口服溶液、25 μL/mL的銀杏提取物和25 μL/mL的蜜環提取物。4 h糖氧剝離后加入藥品作用,并立即復糖復氧培養并在10 h后收集活細胞進行凋亡的含量測定。

注：與假手術組(正常對照組)比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01;與銀杏提取物比較,▲▲P<0.01;與蜜環提取物比較,□□P<0.01

根據PI/Annexin V雙染色采用流式細胞儀分析細胞凋亡率,結果見以下圖表所示。從圖中可以看出,當采用缺氧缺糖處理細胞后,細胞的凋亡率明顯提高(Annexin V+/PI-細胞),其差距具有顯著性意義,這說明缺氧缺糖能夠促進細胞的凋亡過程。25 μL/mL、15 μL/mL的銀杏蜜環口服溶液、25 μL/mL的銀杏提取物和25 μL/mL的蜜環提取物可有效減輕缺氧缺糖引發的細胞凋亡,各給藥組之間差異無統計學意義。見表2、圖6。

圖1 銀杏蜜環口服溶液對缺氧缺糖/復氧復糖誘導 腦微血管內皮細胞自噬蛋白表達的影響

圖2 銀杏蜜環口服溶液對缺氧缺糖/復氧復糖誘導腦 微血管內皮細胞自噬蛋白LC3II/LC3I的影響

注：與模型組比較，*P<0.05

圖3 銀杏蜜環口服溶液對缺氧缺糖/復氧復糖誘導 腦微血管內皮細胞eNOs磷酸化的影響

注：與模型組比較，*P<0.05

圖4 銀杏蜜環口服溶液對缺氧缺糖/復氧復糖誘導 腦微血管內皮細胞自噬蛋白Beclin-1的影響

注：與假手術組(正常對照組)比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

表2 銀杏蜜環口服溶液對缺氧缺糖/復氧復糖 誘導SH-SY5Y細胞凋亡后各亞群 細胞數的影響

注:與正常對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01

圖5 銀杏蜜環口服溶液對缺氧缺糖/復氧復糖誘導 腦微血管內皮細胞凋亡蛋白Caspase-3的影響

注：與假手術組(正常對照組)比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

圖6 流式細胞術測定PI/Annexin V每組典型圖片

3 討論

腦缺血引起的神經元死亡形式主要包括自噬、凋亡和壞死。自噬是溶酶體對細胞內的部分細胞質、細胞器等進行的一系列降解過程的統稱。適度的自噬是細胞正常生長發育和穩態維持的重要途徑[5]。另一方面,自噬可引起Ⅱ型程序性死亡(Programmed Cell Death Ⅱ,PCDⅡ),又稱自噬性細胞死亡(Autophagic Cell Death,ACD),為一種半胱天冬酶(caspase)相關性死亡[6]。本研究深入評價了銀杏蜜環口服溶液對缺氧缺糖再灌注誘導腦微血管內皮細胞中eNOs介導的Beclin-1依賴的自噬通路的影響。腦損傷后產生的炎性因子IL-1β、TNF-α和IL-6在神經元壞死、炎性脹亡和接下來的繼發性損傷中發揮重要作用,也和細胞自噬過程密不可分。缺血缺氧再灌注后神經元、膠質細胞和腦微血管內皮細胞均可產生炎性因子。本研究采用缺氧缺糖再灌注誘導腦微血管內皮細胞構建糖氧剝離+復糖復氧模型,同時給予不同濃度的銀杏蜜環口服溶液及有效組分進行干預,并且通過觀察細胞培養上清炎性因子IL-1β、TNF-α和IL-6的濃度和自噬通路的活化,來探討銀杏蜜環口服溶液的腦保護機制。結果表明,銀杏蜜環口服溶液高、中、低3個劑量組均可抑制上清液TNF-α、IL-1β和IL-6含量,可明顯抑制Caspase3和Beclin-1表達,其中對L-1β和IL-6的作用明顯優于銀杏葉提取物和天麻蜜環菌。本實驗發現銀杏蜜環口服溶液可通過促進一氧化氮合酶eNOs的磷酸化來抑制缺糖缺氧再灌引發的細胞凋亡和自噬。同時其中銀杏蜜環口服溶液中劑量(2.575 mg/mL)對IL-1β和IL-6含量的抑制明顯優于銀杏提取物(0.075 mg/mL)和蜜環提取物(2.5 mg/mL)。

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[4]鄭詠秋,姚明江,劉建勛,等.華佗再造浸膏對大鼠局灶性腦缺血/再灌注血腦屏障損傷的保護作用及機制研究[J].中國中藥雜志,2013,38(4):585-590.

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