降糖消脂片對肥胖大鼠模型的影響

金 龍 葛爭艷 董小霞 楊 斌 李宏坤 郭宇潔 任 燁 洪曉華 王楊慧 劉建勛

(中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎醫(yī)學研究所,中藥藥理北京市重點實驗室,北京,100091)

肥胖癥是一種慢性代謝性疾病,是導致高血壓、心臟病、2型糖尿病及腦卒中等疾病的重要危險因素,肥胖癥已經成為目前世界范圍內最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一[1]。肥胖癥與過度進食、偏食高脂肪類食物及缺乏運動等密切相關,是由遺傳因素、環(huán)境因素等多種因素相互的結果,其具體發(fā)病原因尚不清楚[2]。降糖消脂片來源于臨床經驗方,由女貞子、黃芪、黃連、荔枝核、昆布等中藥組成,具有益氣養(yǎng)陰,行氣通絡之功效,是治療糖尿病前期糖脂代謝紊亂,癥見乏力、困倦、多汗、頭暈、口干、多飲、易饑、尿頻、大便不爽、肢體麻木,舌質黯紅、苔白微膩或黃膩、舌下靜脈迂曲,脈弦細或濡或滑等。前期臨床研究顯示,該方劑可以有效的降低糖尿病患者體質量及體質量指數(shù)(BMI),改善患者炎性反應及纖溶活性[3]。進一步的動物實驗顯示,降糖消脂片降糖消脂片對KK-Ay糖尿病肥胖小鼠有明顯的降糖、降脂及改善胰島素抵抗的作用[4]。本研究觀察降糖消脂片對單純性肥胖(Diet Induced Obesity,DIO)大鼠模型的影響,為臨床應用提供實驗依據(jù)和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD雄性大鼠,體質量(130.43±7.15) g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,許可證編號:SCXK(京)2009-0007。參考文獻方法制定高脂飼料[5]:豬油10%、蔗糖10%、膽固醇1.5%、膽鹽0.5%、蛋黃粉5%、普通飼料73%,由北京華阜康生物科技股份有限公司加工。

1.1.2 藥物 降糖消脂片,實驗用其干粉,5.4 g生藥/g粉,由中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎醫(yī)學研究所藥化研究室提供,批號20100308;鹽酸二甲雙胍片,北京協(xié)和藥廠產品,批號101205;辛伐他汀片,杭州默沙東制藥業(yè)有限公司產品,批號09547。

1.1.3 試劑與儀器 血脂試劑盒:均為中生北控生物科技股份有限公司產品,TC批號111511,TG批號114491,HDL-C批號110531,LDL-C批號110571;FFA試劑盒:由北京尚柏生物醫(yī)學技術有限公司提供,批號120210。全自動生化分析儀,日立7080型(日本產);生物組織包埋機,TB-718型,常州市中威電子儀器有限公司產品;組織切片機RM2235型,德國Leica產品;烤片機,HI1220型,德國Leica產品;全自動組織脫水機,ST5020型,德國Leica產品;顯微鏡,日本OLYMPUS公司BX41型。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 動物模型制備周期為18周,給藥周期為8周。即大鼠分為普通飼料組和高脂飼料組進行喂養(yǎng),4周、6周、8周、12周及18周時(大鼠禁食16 h),分別取對照組和高脂飼料組數(shù)只,尾尖采血進行TC、TG測定,每次抽測均選同一批動物,以便動態(tài)觀察。待血脂升高至與對照組差異有統(tǒng)計學意義時,麻醉動物,稱體質量后用皮尺測量大鼠身長(鼻尖至尾根的長度)及尾長(尾根至尾尖的長度),計算藥前Lee′s指數(shù),再進行心臟取血,分離血清測定TC、TG,高脂組大鼠體質量和血脂均升高,可進行分組。普通飼料組為對照組(12只),高脂飼料組(72只)分為模型組、二甲雙胍組(0.3 g/kg)、辛伐他汀組(4 mg/kg)、降糖消脂片8、4、2 g生藥/kg組。除對照組外,各組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。(因造模動物心臟取血后,有10余只大鼠死亡,故實驗后期動物由每組12只變?yōu)槊拷M10只)。

1.2.2 給藥方法 連續(xù)灌胃給藥2個月,體積為10 mL/kg;對照組和模型組灌胃等體積滅菌水。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 造模18周大鼠體質量的變化 造模期間,隔周稱體質量。

1.2.3.2 造模18周大鼠攝食量測定 造模期間,隔周稱飼料(每籠定量加料,第2天稱余料),計算每100 g體質量的攝食量,至造模18周。攝食量=(加料-余料)/籠總體質量×100。

1.2.3.3 造模18周大鼠Lee′s指數(shù)測定 麻醉動物,稱體質量、量身長及尾長,計算造模后Lee′s指數(shù)。Lee′s指數(shù)=[體質量(g)×103/身長(cm)]1/3。

1.2.3.4 造模18周大鼠血脂測定 麻醉動物,心臟取血,分離血清,用生化儀測定TC、TG。

1.2.3.5 給藥8周大鼠體質量的變化 每周稱體質量。

1.2.3.6 給藥8周大鼠攝食量測定 每周稱體質量及攝食,計算每100 g體質量的攝食量。

1.2.3.7 給藥8周大鼠Lee′s指數(shù)測定 麻醉動物,稱體質量、量身長及尾長,計算給藥后的Lee′s指數(shù)。

1.2.3.8 給藥8周大鼠血脂測定 麻醉動物,腹主動脈取血,離心后分離血清,用生化儀進行TC、TG、HDL-C及LDL-C的測定。

1.2.3.9 給藥8周大鼠FFA測定 麻醉動物,腹主動脈取血,離心后分離血清,用生化儀進行測定。

1.2.3.10 肝臟形態(tài)學觀察 各組大鼠解剖取肝臟,10%甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋、切片、HE染色,光鏡下進行肝臟形態(tài)學觀察。采用參比差值法進行肝臟脂肪變性分級(正常:無肝細胞脂肪變性;輕度:肝細胞脂肪變性累及肝組織的1/3以下的肝小葉或僅見個別肝細胞脂肪變性;中度:肝細胞脂肪變性累及肝組織的2/3至1/3的肝小葉;重度:肝細胞脂肪變性累及肝組織的2/3以上的肝小葉并且脂變程度較重)。

1.2.3.11 脂肪病理學觀察 各組大鼠解剖取脂肪,10%甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋、切片、HE染色,光鏡下進行脂肪形態(tài)學觀察。HE染色后進行脂肪細胞計數(shù),計數(shù)每個高倍視野中脂肪細胞數(shù),每組共計30個高倍鏡視野,再取平均值。

2 結果

2.1 造模18周體質量的變化 高脂飼料喂養(yǎng)2周時,與對照組比較,高脂組大鼠體質量明顯降低(P<0.01);造模4周時,高脂組體質量與對照組持平;造模6周時,高脂組體質量超過對照組,但差異無統(tǒng)計學意義;造模8～18周,高脂組體質量明顯高于對照組(P<0.01),說明肥胖模型非常成功。見表1～2。

2.2 造模18周攝食量的改變 高脂飼料喂養(yǎng)2周時,高脂組攝食量與對照組差異無統(tǒng)計學意義;造模4周開始,高脂組各時間點的攝食量與對照組比較明顯降低(P<0.01),可能是由于飼料中脂肪含量較高,導致大鼠進食量減少,但高脂組體質量明顯高于對照組。見表3～4。

2.3 造模18周Lee′s指數(shù)的變化 高脂飼料喂養(yǎng)18周后,高脂組大鼠的體質量和身長與對照組比較均明顯增加(P<0.05～0.01),故Lee′s指數(shù)與對照組比較也明顯增加(P<0.01),尾長則無明顯變化。提示大鼠已明顯肥胖,可取血測定藥前TC、TG等指標。見表5。

2.4 造模18周血脂的變化 由于動物尚未開始給藥,故檢測TC、TG需心臟取血。高脂飼料喂養(yǎng)18周后,高脂組大鼠的TC與對照組比較明顯升高(P<0.01),TG與對照組比較也有所增加(P<0.05),說明大鼠造模后血脂已明顯升高,可進行分組、灌胃給藥。見表6。

表1 大鼠造模后體質量的變化

注:與對照組比較,**P<0.01

表2 大鼠造模后體質量的變化

注:與對照組比較,**P<0.01

表3 大鼠造模后攝食量的變化體質量)

注:與對照組比較,**P<0.01

表4 大鼠造模后攝食量的變化體質量)

注:與對照組比較,**P<0.01

表5 造模18周大鼠Lee′s指數(shù)的變化

注:與對照組比較,**P<0.01

表6 造模18周大鼠血脂的變化

注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.5 降糖消脂片對肥胖大鼠體質量的影響 造模后(給藥前),各組動物體質量明顯高于對照組(P<0.05～0.01),大鼠已明顯肥胖。灌胃給藥后,與模型組比較,降糖消脂片大劑量組從藥后3周開始,體質量有所下降(P<0.05);藥后7周時體質量下降明顯(P<0.01);藥后8周時,大劑量組體質量下降極其明顯(P<0.01),且中劑量組體質量也有所下降(P<0.05)。見表7～8。

表7 降糖消脂片對肥胖大鼠體質量的影響

注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05

表8 降糖消脂片對肥胖大鼠體質量的影響

注:與對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01

表9 降糖消脂片對肥胖大鼠攝食量的影響體質量)

注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較，△P<0.05

表10 降糖消脂片對肥胖大鼠攝食量的影響體質量)

注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

表11 降糖消脂片對肥胖大鼠Lee′s指數(shù)的影響

注:與對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01

表12 降糖消脂片對肥胖大鼠血脂的影響

注:對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.6 降糖消脂片對肥胖大鼠攝食量的影響 與對照組比較,模型組各時間點的攝食量明顯降低(P<0.05～0.01),灌胃給藥后,降糖消脂片中劑量組藥后1周時,攝食量比模型組有所下降(P<0.05),其他各劑量組藥后攝食量與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表9～10。

2.7 降糖消脂片對肥胖大鼠Lee′s指數(shù)的影響 高脂飼料喂養(yǎng)18周后,與對照組比較,模型組大鼠Lee′s指數(shù)明顯升高(P<0.01),說明造模成功。連續(xù)灌胃給藥2個月后,與模型組比較,降糖消脂片大劑量組Lee′s指數(shù)明顯降低(P<0.01),中劑量組Lee′s指數(shù)也有所降低(P<0.05)。見表11。

2.8 降糖消脂片對肥胖大鼠血脂的影響 結果顯示,高脂飼料喂養(yǎng)18周后,與對照組比較,模型組TC、TG、LDL-C、VLDL-C及TC/HDL-C均明顯升高(P<0.05～0.01),說明造模成功。連續(xù)灌胃給藥2個月后,與模型組比較,降糖消脂片大、中劑量組TC和LDL-C明顯降低(P<0.05);TG有下降的趨勢;高劑量組HDL-C明顯升高(P<0.01)、TC/HDL-C明顯降低(P<0.05);低劑量組VLDL-C有所降低(P<0.05)。見表12。

2.9 降糖消脂片對肥胖大鼠FFA等指標的影響 模型組FFA明顯高于對照組(P<0.01);與模型組比較,降糖消脂片各劑量組FFA明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表13。

表13 降糖消脂片對肥胖大鼠FFA等指標的影響

注:與對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01

2.10 降糖消脂片對肥胖大鼠肝臟的影響

2.10.1 肉眼觀察 對照組肝臟呈鮮紅色,邊緣銳利,表面光滑;模型組肝臟體積明顯增高,邊緣變鈍,呈土黃色,質軟,切面有油膩感,呈典型脂肪肝外觀。各給藥組肝臟體積增大,表面呈淺黃色,油膩感略減輕。

2.10.2 形態(tài)學觀察 對照組肝細胞索圍繞中央靜脈呈放射狀排列,肝細胞形態(tài)如常,匯管區(qū)無異常。模型組肝細胞大片脂肪變性,變性方式以胞質內小脂滴為主,肝細胞重度腫脹;肝細胞大片萎縮、壞死,不見殘余的正常肝細胞索;匯管區(qū)炎性反應細胞浸潤。二甲雙胍組肝細胞大片脂肪變性,受累面積較模型組減少,肝細胞中度腫脹;見少量殘余正常肝細胞索,匯管區(qū)炎性反應細胞浸潤。辛伐他汀組肝細胞脂肪變性,受累面積明顯減少,肝細胞輕度腫脹;見多量殘余正常肝細胞索,匯管區(qū)少量炎性反應細胞浸潤。降糖消脂片高劑量組肝細胞輕度脂肪變性,受累面積明顯減少,肝細胞輕度腫脹,見多量殘余正常肝細胞索,匯管區(qū)炎性反應細胞浸潤。降糖消脂片中、低劑量組肝細胞中度脂肪變性,受累面積略減少,肝細胞中度腫脹,匯管區(qū)炎性反應細胞浸潤。見圖1。

圖1 給藥8周各組肥胖大鼠肝臟鏡下照片 (HE染色,×100)

注：A對照組;B模型組;C二甲雙胍0.3 g/kg組;D辛伐他汀4 mg/kg組;E降糖消脂片8 g/kg組;F降糖消脂片4 g/kg組;G降糖消脂片2 g/kg組

2.10.3 肝臟脂肪變性分級 Ridit分析結果顯示,降糖消脂片各劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05～0.01),肝臟脂肪變性有明顯改善。見表14。

表14 降糖消脂片對肥胖大鼠肝臟脂肪 變性程度的影響

注:與對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.11 降糖消脂片對肥胖大鼠脂肪的影響

2.11.1 形態(tài)學觀察 對照組脂肪細胞大小均一,排列勻稱,未見新生脂肪細胞及間質炎性改變。模型組脂肪囊泡大小不等,新生脂肪細胞可見,細胞較小,核圓居中,胞質內見小脂滴。脂肪間血管輕度擴張、充血,少量炎性反應細胞浸潤。二甲雙胍組脂肪囊泡大小不等表現(xiàn)減輕,少量新生脂肪細胞,間質少量炎性反應表現(xiàn)。辛伐他汀組脂肪囊泡大小不等表現(xiàn)減輕,見少量新生脂肪細胞,間質少量炎性反應表現(xiàn)。降糖消脂片大劑量組脂肪囊泡大小不等表現(xiàn)減輕,見少量新生脂肪細胞,間質輕度炎性反應表現(xiàn)。降糖消脂片中、小劑量組脂肪囊泡大小不等表現(xiàn)減輕,見不等量新生脂肪細胞,間質少量炎性反應表現(xiàn)。見圖2。

圖2 給藥8周各組肥胖大鼠脂肪鏡下照片 (HE染色,×400)

注：A對照組;B模型組;C二甲雙胍0.3 g/kg組;D辛伐他汀4 mg/kg組;E降糖消脂片8 g/kg組;F降糖消脂片4 g/kg組;G降糖消脂片2 g/kg組

2.11.2 脂肪細胞計數(shù) 計數(shù)每個高倍視野中脂肪細胞數(shù),每組計30個高倍鏡視野,取平均值。結果表明:與模型組比較,降糖消脂片各劑量組脂肪細胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)。見表15。

表15 降糖消脂片對肥胖大鼠脂肪細胞 數(shù)目的影響

注:與對照組比較,**P<0.01,與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01

3 討論

肥胖和超重是心血管病、糖尿病、慢性腎病、多種癌癥和一系列骨骼肌肉病的風險因素,這一點已經被大量流行病學研究結果證實。肥胖癥在全球范圍內持續(xù)增長,1980—2013年成人肥胖率增加了28%,兒童肥胖率增加達47%,目前約2.1億人口為超重和肥胖[6]。我國肥胖癥也逐年增多,研究顯示我國成年男子腹型肥胖率達35.3%,女性腹型肥胖率則高達51.7%[7]。因而,如何有效防治肥胖及其并發(fā)癥已成為一個嚴重的公共健康問題[8]。

肥胖癥屬于中醫(yī)學“痰證”“水腫”“虛勞”等范疇,現(xiàn)代學者將肥胖癥的常見中醫(yī)證型分為痰濕內盛證、脾虛濕勝證、脾腎陽虛證和胃熱滯脾證,茯苓、白術、澤瀉、大黃、山楂、黃芪、甘草等為治療肥胖癥的最常用中藥[9-10]。降糖消脂片是魏子孝教授基于對2型糖尿病的中醫(yī)病機認識,結合個人臨床體會,汲取中藥藥理研究的成果,擬訂用于治療2型糖尿病的中藥復方。前期的臨床研究結果顯示,除了具有明顯的降糖效果之外,還可以顯著降低糖尿病患者的體質量及體質量指數(shù)[3]。肥胖與2型糖尿病常常共同發(fā)生,肥胖可引起胰島素抵抗和慢性炎性反應狀態(tài),胰島素抵抗會導致2型糖尿病的發(fā)生,肥胖常常是糖尿病前期的常見癥狀[11]。本研究觀察了降糖消脂片對肥胖大鼠體質量及脂質代謝的調節(jié)作用。

世界衛(wèi)生組織(WHO)對成人做出的超重和肥胖定義如下:身體質量指數(shù)等于或大于25時為超重,身體質量指數(shù)等于或大于30時為肥胖[12]。然而,WHO制定的評價肥胖的指標只適用于衡量人的肥胖程度,對大鼠不適用,故本研究采用Lee′s指數(shù)來衡量大鼠的肥胖程度。高脂飼料配方各不相同,含膽鹽的高脂飼料可促進大鼠有效吸收膽固醇與脂肪。由于飼料中脂肪含量高,較油膩,導致大鼠進食量減少,但其體質量明顯增加,出現(xiàn)明顯的肥胖[13]。此時發(fā)生的代謝紊亂主要體現(xiàn)在脂代謝上,表現(xiàn)為血中FFA、TC、TG、LDL-C升高,HDL-C降低。肝臟是脂質和脂肪酸代謝的重要部位,其合成、分解和代謝在嚴密調控系統(tǒng)調節(jié)下保持相對平衡,當某些因素使調控系統(tǒng)受損,肝臟的脂質及脂肪酸過多,則脂肪沉積在肝臟,發(fā)生脂肪肝[14-16]。

肥胖大鼠灌胃給藥2個月后,降糖消脂片高、中劑量組的體質量明顯降低,肥胖癥狀明顯減輕,Lee′s指數(shù)和TC、LDL明顯降低,TG有下降的趨勢;高劑量組HDL明顯升高;降糖消脂片各劑量組FFA明顯降低,肝臟指數(shù)有降低的趨勢。病理結果顯示:降糖消脂片各劑量組的肝臟及脂肪組織的病理變化與模型組比較,有不同程度的減輕;肝臟脂肪變性分級結果顯示:降糖消脂片各劑量組肝臟脂肪變性有明顯改善。過多的脂肪組織釋放較多的FFA,并參與IR的發(fā)生。本實驗中模型組FFA明顯高于對照組,而降糖消脂片各劑量組FFA比模型組明顯降低,差異極其顯著。因此,分析降糖消脂片的降脂機制有可能是通過降低FFA,而改善脂代謝紊亂。

綜上所述,降糖消脂片對肥胖大鼠有明顯減重、降脂、改善肝臟脂肪變性的作用,其機制可能與降低FFA,改善脂代謝紊亂有關。該研究為后期降糖消脂片治療肥胖癥的相關研究打下基礎。

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