益奧源膠囊降血糖藥效學初探與分析

朱友文 趙修南 洪 坤

(湖南金潤藥業開發有限公司，長沙，410000)

益奧源膠囊是按照中醫理論為指導，以主治多渴“參苓散”為基礎加減化裁而成的中藥方劑，以人參、茯苓、甘草、白術、黃芩等藥味組成，具有滋陰固澀、理氣健脾、益肝補腎、潤燥生津之功效。本實驗采用鏈脲酶素結合飼喂高糖高脂飼料致2型糖尿病小鼠模型，觀察益奧源膠囊對糖尿病模型小鼠的降血糖作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級昆明種小鼠60只，體質量16～18 g，雄性，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證編號SCXK(軍)2012-0004。實驗動物飼養環境：室溫20～26 ℃，相對濕度20%～26%，光照良好，自由攝食和飲水。

1.1.2 藥物 益奧源膠囊由湖南金潤藥業開發有限公司提供，為黃色粉末；鹽酸二甲雙胍片(陽性對照藥，中美上海施貴寶制藥有限公司生產，批號AAG45G4)。

1.1.3 試劑與儀器 鏈脲霉素(STZ,Sigma公司生產，批號C8H15N307)；檸檬酸一水結晶(上海翊圣生物科技有限公司生產，批號C06829)；檸檬酸三鈉二水結晶(上海翊圣生物科技有限公司生產，批號C14879)；高糖高脂疾病模型動物飼料塊(北京華阜康生物科技股份有限公司生產)。AR3130奧豪斯電子天平(梅特勒托利斯多儀器(上海)有限公司)；EPS-2001電子天平(長沙湘平科技開發有限公司)；1001實驗室高剪切分散乳化機(江蘇南通克本爾混合設備有限公司)；GU00685575羅氏活力型血糖儀(德國羅氏診斷有限公司)；羅康全活力型血糖試紙(德國羅氏診斷有限公司，批號23471631)；光鏡和電鏡儀器(軍事醫學科學院)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 2型糖尿病小鼠模型的建立：取SPF級正常昆明雄性小鼠110只，體質量14～16 g，普通飼料適應性喂養1周后，隨機留下10只繼續以普通飼料喂養作為正常對照組外，其余喂養高糖高脂飼料6 d后，空腹灌胃以0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.5)配制的鏈脲霉素30 mg/kg，隔日1次，連續6次，正常對照組同步灌胃檸檬酸緩沖液，末次灌胃后3 d，剪尾采血檢測空腹血糖水平。以空腹血糖≥10.0 mmol/L為2型糖尿病模型成功的標志，將血糖未達標或過高的動物剔除，最后將造模成功的小鼠按血糖值的水平隨機分為模型對照組，陽性對照組和益奧源膠囊小、中、大劑量組。

1.2.2 給藥方法 正常對照組，模型動物對照組灌胃等體積的蒸餾水，0.4 mL/20 g,1次/d，陽性藥對照組灌胃鹽酸二甲雙胍，400 mg/kg，益奧源膠囊小、中、大劑量組分別灌胃以益奧源膠囊粉末的混懸液3個劑量(3.0、6.0、12.0 g/kg)。

1.2.3 檢測指標與方法 不同時間定點稱體質量，不同時間定點剪尾測空腹血糖；末次測血糖后，挑選每組接近血糖平均值的小鼠2只，取胰腺作胰島組織病理學觀察和電鏡胰島細胞學觀察。胰島病理組織切片，以電子照片的形式記錄并加以注釋說明。

2 結果

2.1 益奧源膠囊對小鼠體質量的影響 結果顯示，益奧源膠囊小劑量組在給藥后第1周和第3周，與模型對照組比較，小劑量組差異有統計學意義(P<0.05)；第2周、第4周、第5周，與模型對照組比較，小劑量組差異無統計學意義(P>0.05)，但有增加體質量的趨勢。益奧源膠囊中劑量組小鼠在給藥后直至實驗結束體質量與模型對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，但有增加體質量的趨勢。益奧源膠囊大劑量組小鼠在給藥后第1周、第2周、第3周內體質量與模型對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，第4周、第5周、第6周體質量與模型對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，但有增加體質量的趨勢。見表1。

2.2 益奧源膠囊對小鼠血糖水平的影響 結果顯示，益奧源膠囊小劑量組在第1周內血糖水平與模型對照組比較，差異具有極顯著的統計學意義(P<0.01)，在給藥第3周內血糖水平與模型對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，在給藥第4周內血糖水平與模型對照組比較，差異具有顯著的統計學意義(P<0.01)。在給藥第2周、第5周、第6周血糖水平與模型對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，但血糖水平也有下降趨勢。在給藥6周內，益奧源膠囊中、大劑量觀察組小鼠血糖水平與模型組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，但中劑量和大劑量組血糖水平均有下降趨勢。見表2。

表1 益奧源對STZ小鼠體質量的影響

注:與正常對照組比較,*P<0.05、△P<0.01、▲P<0.001,與模型對照組比較，□P<0.05，()內數字為動物只數

表2 益奧源對STZ血糖水平的影響

注:()內數字為動物只數

圖1 組織病理學結果(光學顯微鏡)

2.3 組織病理學結果(光學顯微鏡) 末次測血糖后，挑選每組接近血糖平均值的小鼠2只，取胰腺作胰島組織病理學觀察，胰島病理組織切片，以電子照片的形式記錄并加以注釋說明。6組實驗中，共計12只動物，每組2個照片。放大倍數見標尺。其中，1-1與1-2為正常對照組，結果顯示胰島散在分布，呈圓形或橢圓形，與外分泌腺交界規整清楚，胰島細胞密度適中，細胞核清晰，細胞質淡染，屬于正常胰島細胞；1-3與1-4為模型組，結果顯示胰島數量顯著減少，體積小，胰島細胞密度不勻，部分細胞腫脹，細胞質空泡，部分細胞核固縮，說明胰島細胞受到中度損傷；1-5與1-6為模型對照組，結果顯示胰島數量減少，形狀不規則，胰島細胞密度增加，少數細胞腫脹，細胞質空泡，細胞核固縮，說明胰島細胞通過增生來修復損傷；1-7與1-8為益奧源膠囊小劑量組，其中1-7顯示胰島數量增多，體積增大，但其形狀都不規則，胰島細胞密度呈略微或顯著增加，部分細胞腫大和核固縮，說明胰島細胞通過增生來修復損傷；1-9與1-10為益奧源膠囊中劑量組，1-9結果顯示胰島形狀不規則，大小不勻，胰島細胞密度顯著增加，而1-10結果顯示胰島數量減少，胰島旁有淋巴細胞聚集灶，胰島細胞密度適中，細胞核固縮，這些都說明胰島細胞出現了損傷修復，且局部出現炎性反應；1-11與1-12為益奧源膠囊大劑量組，結果顯示胰島數量減少，胰島細胞密度適中，少數細胞輕度腫脹，細胞質空泡，細胞核固縮，說明胰島細胞進行了損傷修復。見圖1。

2.4 細胞病理學結果(透射電子學顯微鏡) 末次測血糖后，挑選每組接近血糖平均值的小鼠2只，取胰腺作電鏡胰島細胞學觀察，胰島病理組織切片，以電子照片的形式記錄并加以注釋說明。共計12只動物，每只2個圖片。其中，2-1、2-2、2-3為正常對照組，結果顯示胰島β細胞形態規整，細胞內分泌顆粒豐富，細胞器和細胞核結構正常；2-4、2-5、2-6為模型對照組，結果顯示胰島β細胞內分泌顆粒不同程度減少，出現無顆粒空泡，但細胞器結構正常，說明胰島β細胞受到損傷；2-7、2-8、2-9為陽性對照組，結果顯示胰島β細胞內分泌顆粒減少，個別線粒體結構損傷，細胞核結構正常，說明胰島β細胞受損，但較模型對照組減輕；2-10、2-11、2-12為益奧源膠囊小劑量組，結果顯示，2-10的胰島β細胞內分泌顆粒明顯減少，核染色質聚集，2-11的胰島β細胞內分泌顆粒多，結構基本正常，與正常對照組比較差別不大，2-12的胰島β細胞內分泌顆粒較多，細胞器結構正常，但核形狀不規整，說明這些胰島β細胞受損，但較模型對照組減輕；2-13、2-14、2-15為益奧源膠囊中劑量組，結果顯示2-13的胰島β細胞內分泌顆粒明顯減少，2-14和2-15的胰島β細胞內分泌顆粒較多，細胞器結構基本正常，說明這些胰島β細胞受損，但較模型對照組減輕；2-16、2-17、2-18為益奧源膠囊大劑量組，結果顯示2-16和2-17的胰島β細胞內分泌顆粒減少，細胞器結構基本正常，2-18的胰島β細胞內分泌顆粒較多，細胞器結構基本正常，說明這些胰島β細胞受損，但較模型對照組減輕。放大倍數見標尺。見圖2。

3 討論

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是遺傳、環境等因素長期作用所導致的一種慢性、全身性代謝疾病[1-2]，有Ⅰ型和Ⅱ型的區別[3]，是一種全球性的多因素的代謝性疾病，隨著生活水平的提高，DM已成為嚴重威脅中國人健康的慢性疾病[4]世界衛生組織預計2型DM將會成為全球第5大致死性疾病，其具有病程長、預后差、病情反復發作、致死率和致殘率較高等特點[5]并且近年來糖尿病發病有年輕化趨勢[6-7]。指導患者合理運動，鼓勵患者根據自身情況，適當運動，減輕體質量，從而可降低胰島素的抵抗[8]，糖尿病是內分泌代謝紊亂性疾病，可通過多種發病途徑引起血糖的升高。建立理想的糖尿病動物模型，對深入研究糖尿病的病因、發病機制、臨床治療以及預防等至關重要。

當前，治療糖尿病以藥物為主，藥物一般能較好控制血糖，但長期服用會造成不良反應[9]。通過飲食的早期干預[10]，是預防和控制糖尿病發生最安全有效的選擇[11]，中藥防治糖尿病有著西藥不可替代的優勢，具有作用溫和持久、不良反應小、可長期使用等特點。很多用于治療糖尿病的中藥方劑中都含有黃連或其主要成分為黃連生物堿[12]的物質。湯喜蘭等[13]研究了黃連總生物堿對糖尿病大鼠的降血糖作用，發現黃連總生物堿灌胃組能明顯降低其空腹血糖和糖化血清蛋白水平，同時也可顯著降低谷胱甘肽—過氧化物酶活性，從而最終可降低糖尿病大鼠的血糖。已有文獻報道，桑葉中生物堿組分可降低糖尿病小鼠的血糖、促進肝糖合成、增加肝糖原及增強糖尿病動物糖的貯藏能力[14]。另有研究[15]發現，桑葉總生物堿可以有效緩解由高血糖引發的并發癥如脾臟腫大、胸腺萎縮等，明顯降低試驗小鼠血糖值水平，從而起到降血糖作用。

圖2 組織病理學結果(電子顯微鏡)

目前使用的動物模型有遺傳、誘導獲得2種類型[16]。本實驗通過采用STZ誘導的方式破環其胰島β細胞和機體胰島素分泌不足使血糖值持續穩定升高而建立2型糖尿病小鼠[17-18]。STZ能選擇性地破壞胰島β細胞，使機體胰島素分泌減少[19-20]。本實驗通過測定糖尿病小鼠空腹血糖值，并最終對各組篩選的2只小鼠進行病理學組織切片觀察，實驗結果顯示益奧源膠囊具有明顯的降血糖作用，對胰島β細胞也具有顯著的修復作用。但上述結果只是初步的實驗結果，需要開展進一步的、全面的、深入的實驗研究予以證實。

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