鲬?hù)~(yú)肉酶解物抗氧化活性的研究

戴遙，吳勝軍，2，3，舒留泉，王祥鵬，徐亞軍，于夢(mèng)媛，盤(pán)賽昆，2，3，*

（1.淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港222005；2.江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇連云港222005；3.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，淮海工學(xué)院，江蘇連云港222005；4.江蘇天邊漁村食品有限公司，江蘇連云港222005）

肽（peptide）是蛋白質(zhì)水解過(guò)程的中間生成物，具有多種生物活性，包括促進(jìn)免疫、激素調(diào)節(jié)抗疲勞、降血脂等生理作用，且食用安全性極高，容易被人體所吸收[1]。因此，在功能性食品添加劑與多肽藥物研發(fā)過(guò)程中，功能性短肽食品的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用必將對(duì)功能性食品產(chǎn)生不可替代的影響[2]。

鲬?hù)~(yú)（Platycephalus indicus），又名狗腿魚(yú)、秘書(shū)魚(yú)等，屬于硬骨魚(yú)綱，鲬科。分布于太平洋西部和印度洋，我國(guó)黃海與渤海產(chǎn)量較大，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。然而國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)鲬?hù)~(yú)的研究較少，大多集中在生物學(xué)方面[3]，對(duì)鲬?hù)~(yú)中的各種活性物質(zhì)進(jìn)行研究尚未見(jiàn)報(bào)道。而魚(yú)類(lèi)中蛋白質(zhì)含量豐富，是肽的主要來(lái)源，漸漸受到重視，李吉緒等[4]通過(guò)檢測(cè)鰱魚(yú)肽對(duì)DPPH自由基的清除作用、對(duì)羥自由基的清除作用和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用的能力來(lái)研究其體外抗氧化活性，結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)酶解制得的鰱魚(yú)肽具有一定的抗氧化活性。厲望[5]以帶魚(yú)為原料，優(yōu)化帶魚(yú)蛋白的酶解條件，評(píng)價(jià)了酶解物的抗氧化特性，并采用多種分離技術(shù)方法對(duì)抗氧化肽進(jìn)行分離純化，得到抗氧化性最高的組分對(duì)自由基清除率比分離前提高了27%，表明分離純化能明顯提高帶魚(yú)抗氧化肽的抗氧化能力。因此，采用酶定向適度水解技術(shù)制備活性肽是其深加工和高值化利用的重要發(fā)展方向。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

鮮活鲬?hù)~(yú)：連云港水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)；D-脫氧核糖、2-硫代巴比妥酸（生化試劑）：BIO BASIC INC（Canada）；谷胱甘肽（色譜級(jí)）：北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；堿性蛋白酶等（食品級(jí)）；其他試劑均為分析純。

供試酶的活力分別為菠蘿蛋白酶13 996 U/g，胰蛋白酶14 995 U/g，堿性蛋白酶 14 588 U/g，胃蛋白酶34 727.4 U/g，木瓜蛋白酶7 485.6 U/g。

1.2 主要儀器設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī)（ALpHA-4）：德國(guó)CHRIST公司；紫外分光光度計(jì)（UV754N）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16M）：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水解度（DH）的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[6]采用pH-stat法測(cè)定。

式中：V為堿液體積，mL；C為堿液的摩爾濃度，mol/L；m為底物質(zhì)量，g；40為水解液稀釋倍數(shù)。

1.3.2 清除羥自由基能力測(cè)定

采用酶解物對(duì)于Fenton體系產(chǎn)生羥自由基清除率的體外試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定[7-8]。

1.3.3 肽含量的測(cè)定

采用雙縮脲試劑法[9]，以氧化型谷胱甘肽為標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品肽含量。

1.3.4 鲬?hù)~(yú)酶解工藝

1.3.4.1 鲬?hù)~(yú)的預(yù)處理

將新買(mǎi)回來(lái)的鲬?hù)~(yú)去頭去內(nèi)臟，洗凈，瀝干，分裝，置于－40℃冰箱預(yù)凍48 h以上，取出置于托盤(pán)，放入冷凍干燥機(jī)中干燥，粉碎，用索氏抽提脫脂，再把石油醚揮發(fā)完畢之后用超微粉碎機(jī)再次粉碎，取出后分裝，放在干燥器內(nèi)，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 鲬?hù)~(yú)蛋白酶解液的制備

準(zhǔn)確（0.001 g）稱(chēng)取4 g鲬?hù)~(yú)干粉放入三角瓶中，加200mL雙蒸水配液，調(diào)節(jié)pH值，加入一定的酶，在適當(dāng)?shù)臏囟认旅附猓?0 min測(cè)一次水解度，直到達(dá)到特定水解度為止，將酶解液裝于離心管中，10 000 r/min，4℃，離心15 min，取上清液，于冰箱中保存，備用。

1.3.5 酶的選擇

按表1控制5種酶在適宜的條件下酶解鲬?hù)~(yú)，加酶量均為2 000 U/g蛋白，根據(jù)水解進(jìn)程確定適宜的酶。

表1 供試蛋白酶作用條件Table 1 Hydrolysis conditions of tested proteinase

1.3.6 酶解單因素試驗(yàn)

影響酶解作用的因素一般為pH值，溫度，加酶量，固液比，酶解時(shí)間5個(gè)單因素。以羥自由基清除率和水解度為指標(biāo)，考察各因素對(duì)堿性蛋白酶水解作用及產(chǎn)物抗氧化活性的影響。

1.3.6.1 時(shí)間影響

固液比 1 ∶50（g/mL），pH=8，酶量 2 000 U/g蛋白，溫度 50 ℃，時(shí)間設(shè)置為 30、60、90、120、150 min。

1.3.6.2 pH值影響

固液比 1∶50（g/mL），溫度：50℃，酶量 2 000 U/g蛋白，酶解時(shí)間由1.3.6.1的試驗(yàn)結(jié)果確定，pH值分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。

1.3.6.3 溫度影響

固液比1∶50（g/mL），pH值取1.3.6.2確定的最適合的pH值，酶量2 000 U/g蛋白，酶解時(shí)間由1.3.6.1的試驗(yàn)結(jié)果確定，溫度分別為 40、45、50、55、60 ℃。

1.3.6.4 酶量影響

固液比 1∶50（g/mL），溫度：取 1.3.6.3確定的最適溫度，pH值取1.3.6.2確定的最適合的pH值，酶解時(shí)間由1.3.6.1的試驗(yàn)結(jié)果確定，酶量分別為1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500U/g蛋白。

1.3.6.5 固液比影響

按固液比 1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45、1 ∶50（g/mL）配成懸浮液，調(diào)整溫度、pH值、酶量至以上1.3.6.2～

1.3.6.4的試驗(yàn)結(jié)果確定的值，水解時(shí)間由1.3.6.1的試驗(yàn)結(jié)果確定值。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)清除率有顯著影響的因素，采用Design Expert 6.0軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，分析數(shù)據(jù)，構(gòu)建數(shù)學(xué)回歸模型，求解最優(yōu)參數(shù)，因素水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of response experiment design

1.3.8 IC50測(cè)定

采用倍比稀釋的方法對(duì)樣品進(jìn)行系列稀釋?zhuān)瑴y(cè)定其對(duì)自由基的清除率，根據(jù)樣品的肽含量計(jì)算各稀釋度的肽含量，作圖，擬合量效關(guān)系，根據(jù)擬合方程計(jì)算IC50。

1.3.9 相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定

利用凝膠層析法測(cè)定酶解物的分子量分布，通過(guò)Sephadex G-15柱（φ1.1 cm×50 cm）進(jìn)行分析檢測(cè)。樣品的分子量通過(guò)洗脫體積根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 鲬?hù)~(yú)蛋白酶解物清除·OH能力測(cè)定

鲬?hù)~(yú)肉5種蛋白酶解液對(duì)·OH的清除作用如圖1。

由圖1可知，在5種供試酶中堿性蛋白酶的酶解物清除羥自由基的作用最強(qiáng)，水解30 min時(shí)供試酶的水解物均呈現(xiàn)較大的清除能力，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，不同酶的水解物清除羥自由基的能力出現(xiàn)不同的上下波動(dòng)，但堿性蛋白酶的水解物具有較穩(wěn)定羥自由基清除能力，所以選取堿性蛋白酶進(jìn)行下面的試驗(yàn)。

圖1 不同時(shí)間下酶解物對(duì)羥自由基的清除作用Fig.1 The scavenging effect of hydrolysates on hydroxyl free radical in different times

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基的影響

時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基的影響如圖2。

圖2 時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶清除羥自由基的影響Fig.2 The effect of different time to scavenging of Alacasle

圖2顯示，羥自由基清除率在30 min時(shí)即達(dá)到了較高的水平，隨時(shí)間的延長(zhǎng)維持在一個(gè)較穩(wěn)定的狀態(tài)。水解度則隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)緩慢的升高趨勢(shì)，210 min時(shí)達(dá)到最大。

2.2.2 pH值對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基的影響

pH值對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基能力的影響如圖3所示。

圖3 pH值對(duì)堿性蛋白酶清除羥自由基能力的影響Fig.3 The effect of pH to scavenging of Alacasle

堿性蛋白酶水解物對(duì)羥自由基的清除能力在選定的范圍內(nèi)隨pH值增大波動(dòng)不大，偏堿條件下水解度相對(duì)較高。

2.2.3 溫度對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基的影響

溫度對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基能力的影響如圖4。

圖4 溫度對(duì)堿性蛋白酶清除羥自由基能力的影響Fig.4 The effect of temperature to scavenging of Alacasle

圖4所示，堿性蛋白酶水解物清除羥自由基和水解度隨溫度的變化并不一致，50℃時(shí)水解度最大，但此時(shí)清除率處于較低的水平，55℃清除率和水解度都處在相對(duì)較高的水平，因此取55℃為適宜溫度。

2.2.4 加酶量對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基的影響

加酶量對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基能力的影響如圖5。

圖5 酶量對(duì)堿性蛋白酶清除羥自由基能力的影響Fig.5 The effect of enzyme substrate ratio to scavenging of Alacasle

從圖5可以看出，堿性蛋白酶水解物清除羥自由基的能力在加酶量為1 000 U/蛋白～2 500 U/g蛋白時(shí)無(wú)較明顯波動(dòng)，之后開(kāi)始提升，清除率在3 000 U/g蛋白時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)酶量超過(guò)3 000 U/g蛋白時(shí)，清除率隨酶量增加而有所減小。隨著加酶量的增加，水解度一直保持在一定范圍內(nèi)，無(wú)明顯變化。

2.2.5 固液比對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基的影響

固液比對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基能力的影響如圖6。

如圖6所示，堿性蛋白酶水解物對(duì)羥自由基的清除能力在1∶30（g/mL）時(shí)最大，隨著固液比增加而減小，當(dāng)固液比為1∶40（g/mL）時(shí)清除率最低，而后隨著固液比增加清除率也增加。水解度在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，但不顯著。

圖6 固液比對(duì)堿性蛋白酶清除羥自由基能力的影響Fig.6 The effect of solid-liquid ratioto scavenging of Alacasle

2.3 響應(yīng)面結(jié)果與分析

依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，由響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理，對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)安排和結(jié)果分析見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)安排及結(jié)果Table 3 Experiment arrangement and results of response surface method design

經(jīng)Design-Expert 6.0.10分析發(fā)現(xiàn)，2FI模型合適擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，去除不顯著項(xiàng)后，模型方差進(jìn)行相應(yīng)分析如表4所示。

表4 優(yōu)化后的模型方差分析表Table 4 The ANOVA table of the model after optimization

續(xù)表4 優(yōu)化后的模型方差分析表Continue table 4 The ANOVA table of the model after optimization

從表4可以看出，模型和失擬項(xiàng)的P值分別為0.006 3與0.615 7，表明該模型擬合良好。模型的各項(xiàng)中，A項(xiàng)、C項(xiàng)、A與B的交互作用對(duì)響應(yīng)值有極顯著影響（P≤0.01），B項(xiàng)、A與C的交互作用對(duì)響應(yīng)值有顯著影響（0.05≤P≤0.1）。羥自由基清除率（SA%）與因素的回歸方程為：

SA/%=-1 446.812 49+209.133 94A+22.195 39B+12.841 71C-2.957 84AB-1.896 68AC

式中：A為pH值；B為溫度，℃；C為固液比，g/mL。

回歸模型的最優(yōu)解為：A=9.0、B=40、C=40，即最優(yōu)的酶解條件是：pH值為9.0、溫度為40℃、固液比為1 ∶40（g/mL）、加酶量 3 000 U/g蛋白、時(shí)間 180 min，在此條件下，SA的模型預(yù)測(cè)值為89.23%。

2.4 抗氧化肽的半清除濃度（IC50）

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖7。

圖7 肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.7 Standard curve of peptide

2.4.2 肽含量的測(cè)定

采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳條件進(jìn)行酶解得到酶解物，測(cè)得OD值，帶入肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到酶解液的肽含量為3.02 mg/mL。

2.4.3 酶解物羥自由基清除率IC50

酶解物肽含量與羥自由基清除作用量效關(guān)系如圖8。

圖8 肽含量與羥自由基清除率的量效關(guān)系Fig.8 The relationship between hydroxyl radical scavenging and peptide content

如圖8所示，酶解物肽含量與羥自由基清除率呈很好的線(xiàn)性關(guān)系，采用Excel進(jìn)行線(xiàn)性擬合得到擬合方程，根據(jù)方程計(jì)算得IC50為0.58 mg/mL。

2.5 分子量分布測(cè)定

用pH7.5磷酸緩沖液作為洗脫液，流速0.7mL/min，上樣量為1.5 mL，QuadTecTM檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。測(cè)得Sephadex G-15柱的Vo（流動(dòng)相體積）是 17.95 mL，Vt（柱總體積）是 38.94 mL，根據(jù)保留各標(biāo)準(zhǔn)物的時(shí)間求出對(duì)應(yīng)的Ve（洗脫體積），L-酪氨酸（Mr=181.19）的 Ve是 49.81 mL，輔酶 I（NAD，Mr=681.44）的Ve是30.93 mL，短桿菌肽鋅（Bacit racin zinc，Mr=1 486.2）的 Ve是 23.82 mL，卡托普利（Mr=217.29）的Ve是45.14 mL，氧化型谷胱甘肽（Mr=612.63）的Ve是31.10。根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)物Ve計(jì)算出有效分的配系數(shù)為Kav，制成標(biāo)準(zhǔn)物曲線(xiàn)如圖9。

圖9 SepHadex G-15柱標(biāo)準(zhǔn)物校準(zhǔn)Fig.9 Standard curve of Standard material on SepHadex G-15

采用凝膠過(guò)濾層析分析出鲬?hù)~(yú)酶解物層析圖譜如圖10。

分子量分布采用凝膠過(guò)濾層析，峰1出現(xiàn)在168 min，峰 2出現(xiàn)在 192 min，峰 3出現(xiàn)在 216 min，峰4出現(xiàn)在230 min，又因?yàn)榱魉贋?.7 mL/min，經(jīng)過(guò)計(jì)算得出峰1的相對(duì)分子質(zhì)量為3 010，峰2的相對(duì)分子質(zhì)量為2 163，峰3的相對(duì)分子質(zhì)量為794，峰4的相對(duì)分子質(zhì)量為268。

圖10 鲬?hù)~(yú)酶解物SepHadex G-15層析圖譜Fig.10 Chromatography of hydrolysates of protein from Platycephalus indicus

3 結(jié)論

在供試的5種蛋白酶中堿性蛋白酶是最適合水解鲬?hù)~(yú)蛋白制備具有抗氧化活性肽的水解酶。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到堿性蛋白酶酶解鲬?hù)~(yú)蛋白的最佳條件為：溫度40℃，時(shí)間180 min，pH=9.0，降低了水解溫度，縮短了水解時(shí)間，有效地提高了水解效率，在此條件下獲得的鲬?hù)~(yú)酶解物清除羥自由基的IC50值為0.58 mg/mL，肽含量為3.02 mg/mL。分子量分布測(cè)定結(jié)果顯示，鲬?hù)~(yú)蛋白酶解物主要是相對(duì)分子質(zhì)量為268～3 010的小肽和寡肽。

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