基于蜂蜜中氨基酸的毛細管電泳指紋圖譜構建

毛月慧，畢曉彤，閆師杰，劉翠翠

（天津農學院食品科學與生物工程學院，天津300384）

蜂蜜，因其獨特的營養價值和保健功效，被人們譽為大自然最完美的營養品，深受廣大消費者的青睞。近年來，由于蜂蜜產量供不應求，有些企業為了提高產量經常在蜂蜜中勾兌玉米糖漿、大米糖漿、甜菜糖漿、木薯糖漿、蔗糖、飴糖等造假成分[1]。然而，我國現行的蜂蜜食品安全標準中在蜂蜜辨偽方面存在漏洞，導致不法商販的造假行為屢禁不止，國內蜂蜜行業遭遇嚴重的信任危機。

毛細管電泳指紋圖譜技術是利用毛細管電泳技術得到的能夠代表該樣品特性的色譜數據資料的技術。目前，在中藥材質量評價方面應用比較廣泛[2-4]。周賢婧等首次將毛細管電泳技術用于蜂蜜中氨基酸含量的測定，旨在為蜂蜜的蜜源鑒別及質量評估提供借鑒方法。該方法實現了9種氨基酸的基線分離[5]。然而蜂蜜中氨基酸種類豐富，構建蜂蜜中常見氨基酸指紋圖譜必將成為蜂蜜質量評估更為可靠的方法。細菌纖維素（Bacterial cellulose，BC）是由葡萄糖以 β-1，4-糖苷鍵連接而成的高分子化合物，與植物纖維素相比，BC具有許多獨特性質，比如：超細網狀纖維結構，比表面積大，氫鍵結合能力強[6]。BC作為一種具有多孔網狀結構及一定孔徑分布的新型納米生物材料，目前已有研究報道以BC為原料制備吸附型濾膜用于大分子蛋白及無機重金屬離子的分離[7-8]。這些結果表明：BC在毛細管電泳分離領域具有潛在的應用價值。

本研究針對消費者對高效、權威蜂蜜辨偽技術的迫切需求，基于毛細管電泳技術便捷、高效、快速、樣品用量極小等優點[9-10]，結合指紋圖譜技術在辨偽領域的應用潛力，構建蜂蜜中常見的17種氨基酸毛細管電泳指紋圖譜，并實現準確定量，為天然蜂蜜質量控制提供新參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

貝克曼P/ACE MDQ毛細管電泳儀配激光誘導熒光檢測器（Ex 488 nm，Em 520 nm）：美國貝克曼庫爾特有限公司；毛細管（50 μm）：河北永年光纖廠；pH計：瑞士METTLER-TOLEDO公司；萬分之一分析天平：德國梅特勒公司；單道微量可調移液器：德國Eppendorf公司；水系針頭過濾膜（0.22 μm）：菲羅門科技發展有限公司；玻璃儀器：天津玻璃儀器廠。

1.2 試劑與材料

BC：海南億德食品有限公司；732陽離子交換樹脂：麥克林試劑公司；17種氨基酸標準品：麥克林試劑公司；異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）：美國Sigma公司；鹽酸：天津市化學試劑一廠；氫氧化鈉（NaOH）：天津光復精細化學研究所；硼砂（Na2B4O7）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）：天津市化學試劑一廠；實驗用水為二次去離子水。蜂產品包括洋槐蜜、棗花蜜及蜂王漿蜜膏：市售。

1.3 試驗方法

1.3.1 BC處理

市售BC呈片狀，本研究采用酸水解法對BC進行處理[11]。具體操作步驟如下：稱取3 g干燥BC于燒杯，加入150 mL蒸餾水2 500 r/min攪拌勻漿3 min，4000 r/min離心10min。去上清，在沉淀中加入100mL 50%硫酸溶液，50℃水解，5 h后加入500 mL蒸餾水終止反應。靜置過夜，除去上層清液，對下層產物進行離心洗滌直至中性，離心轉速10 000 r/min。最后冷凍干燥備用。

1.3.2 溶液配制

1.3.2.1 氨基酸標準液配制

準確稱取氨基酸標準品，用去離子水配成0.1 mmol/L氨基酸標準溶液，4℃儲存備用。

1.3.2.2 電泳緩沖液配制

由去離子水分別配制不同濃度的Na2B4O7，NaH2PO4溶液；然后，按照需要配制不同pH電泳緩沖液。上儀器前緩沖液需要過膜超聲處理。

1.3.2.3 FITC丙酮溶液

準確稱取5.0 mg FITC溶于10 mL丙酮，配成1.3 mmol/L，-20℃保存備用。

1.3.3 樣品制備

蜂蜜中氨基酸提取采用固相萃取法[12]。①活化：732陽離子交換樹脂由飽和NaCl溶液、1 mol/L NaOH溶液1.5 mol/L鹽酸溶液分別浸泡8 h，最后以去離子水沖至中性并裝柱。②氨基酸吸附：準確稱取蜂蜜5.0 g，加入40 mL去離子水攪拌溶解后，用鹽酸調節pH 2.0，過 732陽離子交換樹脂柱（16 mm×300 mm），流速為1 mL/min。③氨基酸洗脫：以50 mL 2 mol/L氨水洗脫，流速1.0 mL/min，收集氨水部分，50℃蒸干溶劑，用去離子水溶解定容至10 mL。

1.3.4 氨基酸衍生化

取0.1mmol/L氨基酸標準溶液1mL，加入1.3 mmol/L FITC 0.1 mL，漩渦震蕩1 min，4℃避光反應2 h。

1.3.5 標準曲線繪制

將1.3.4氨基酸衍生物稀釋至所需濃度，進樣分析。以氨基酸衍生物濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.6 電泳條件

毛細管（內徑：50 μm；有效長度 45 cm）使用前分別用1.0 mol/L鹽酸、1.0 mol/L NaOH溶液和去離子水各沖洗3 h；每天實驗前毛細管用1.0 mol/L鹽酸、0.1 mol/L NaOH溶液、去離子水及分離緩沖溶液各沖洗5 min；兩次運行之間，毛細管依次用0.1 mol/L NaOH沖洗1 min，去離子水沖洗2 min，分離緩沖溶液沖洗3 min。分離電壓25 kV；分離柱溫25℃；壓力進樣0.5 psi（34 475 Pa）3 s；運行緩沖液：30 mmol/L Na2B4O7-NaH2PO4（pH 9.8，包含0.5%BC素）緩沖液。

2 結果與討論

2.1 分離緩沖液種類選擇

分離緩沖液種類對17種氨基酸分離效果的影響見圖1。

圖1 分離緩沖液種類對17種氨基酸分離效果的影響Fig.1 Effect of running buffer on separation of 17 amino acids

不同的電泳緩沖液對分離物的溶解能力不同，進而影響遷移時間和分離度。此外，電泳緩沖液的選擇主要取決于所需的pH。FITC熒光強度對環境pH較為敏感，pH低于7時，其熒光強度會顯著猝滅，pH 9～10時，熒光強度基本達到峰值。本試驗考察了磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液及硼砂-磷酸鹽緩沖液對氨基酸分離效果的影響。結果如圖1顯示硼砂-磷酸鹽緩沖液能實現17種氨基酸的基線分離。因此，選擇硼砂-磷酸鹽緩沖液作為分離電解質溶液。

2.2 分離緩沖液pH優化

分離緩沖液pH對17種氨基酸分離效果的影響見圖2。

圖2 分離緩沖液pH對17種氨基酸分離效果的影響Fig.2 Effect of running buffer pH on separation of 17 amino acids

分離緩沖液pH直接影響分析物解離情況及帶電荷情況，進而影響分析物保留情況及分離效果。本試驗考察了9.6、9.8、10.0 3個pH梯度對氨基酸分離效果的影響。如圖2所示，在此pH條件下絕大多數氨基酸凈電荷為負值，與毛細管內壁的硅羥基無吸附作用。但隨著凈負電荷的增多，電遷移速度增加，最終導致保留時間延長。此外，隨著pH變化，各氨基酸帶電量直接影響了他們的保留情況及分離效果。綜合考慮，選擇9.8作為分離緩沖液最佳pH。

2.3 分離緩沖液離子強度的選擇

分離緩沖液離子強度對17種氨基酸分離效果的影響見圖3。

圖3 分離緩沖液濃度對17種氨基酸分離效果的影響Fig.3 Effect of running buffer concentration on separation of 17 amino acids

在毛細管電泳分離過程中，分離緩沖液離子強度是影響分析物遷移行為的關鍵因素之一。隨著分離緩沖液濃度從25 mmol/L增加到35 mmol/L，雙電層厚度減小，導致電滲流減小，分析時間從22 min延長至30 min。同時，分離緩沖液濃度增加還會使得電流強度及熱效應增加，加劇分離物縱向擴散，致使峰形展寬。綜合考慮分析時間和峰形，選擇30 mmol/L作為分離緩沖液最佳濃度。

2.4 分離電壓優化

高電壓能夠通過提高電場強度直接縮短分析時間，同時在一定程度上改善峰形。但是電壓過高同樣使熱效應增加，降低柱效和分離度。本試驗選擇25 kV作為最佳分離電壓。

2.5 BC添加量優化

BC添加量對17種氨基酸分離效果的影響見圖4。

圖4 BC對17種氨基酸分離效果的影響Fig.4 Effect of BC on separation of 17 amino acids

BC的添加對于氨基酸分離效果有明顯的改善作用，如圖4所示，當添加量為0.5%時，17種氨基酸基本達到基線分離。繼續增加BC添加量，不但不能改善分離效果，還會造成電流不穩甚至斷電流。因此BC最佳添加量為0.5%。

2.6 分析方法評價

以氨基酸濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標建立標準曲線。各種氨基酸檢測限、線性范圍、回歸方程及相關系數見表1。

表1 17種氨基酸的線性方程、相關系數、線性范圍及檢出限Table 1 Regression equations，correlation coefficients（r2），linear ranges and limit of detection of 17 amino acids

2.7 精密度

17種氨基酸保留時間及峰面積精密度計算結果如表2所示。

表2 17種氨基酸日間、日內測定精密度Table 2 Intra-day and inter-day precision of 17 amino acids

同一日內，對氨基酸衍生液（5×10-8mol/L）連續測定11次，計算各氨基酸峰面積、保留時間的相對標準偏差（Relative standard deviation，RSDs）得到日內精密度。每日配置新鮮試劑對氨基酸衍生，連續5天進行測定，計算各氨基酸峰面積、保留時間的RSDs，得日間精密度。

2.8 加標回收試驗及實際樣品測定

洋槐蜜中17種氨基酸的加標回收率如表3所示。

表3 洋槐蜜中17種氨基酸的加標回收率（X±SD，n=3）Table 3 Recoveries of 17 amino acids spiked in honey（mean±SD，n=3）

續表3 洋槐蜜中17種氨基酸的加標回收率（X±SD，n=3）Continut table 3 Recoveries of 17 amino acids spiked in honey（mean±SD，n=3）

續表3 洋槐蜜中17種氨基酸的加標回收率（X±SD，n=3）Continut table 3 Recoveries of 17 amino acids spiked in honey（mean±SD，n=3）

向已知分析物含量的洋槐蜜樣品中分別加入100.00、200.00、500.00 mg/kg 3個不同的濃度水平的氨基酸標品，提取后通過該方法測定回收率。結果顯示，回收率均在81.10%以上，RSD小于8.22%。

將該方法用于洋槐蜂蜜、棗花蜂蜜及蜂王漿3種蜂制品中氨基酸組成分析。圖5為3種蜂制品典型的氨基酸特征圖譜，各氨基酸含量列于表4。

圖5 3種蜂產品中氨基酸指紋圖譜Fig.5 Fingerprints of amino acids in three bee products

由于蜜源不同，各蜂制品中氨基酸含量及組成差異較大。蜂王漿中含有17種氨基酸，總含量達2 987.61 mg/kg。洋槐蜂蜜中不含精氨酸和蛋氨酸，棗花蜂蜜中不含酪氨酸、蛋氨酸和胱氨酸，氨基酸總量分別為1 147.89 mg/kg和1 389.22 mg/kg。亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸在3種蜂制品中含量均相對較高。其中棗花蜜中苯丙氨酸含量最高為336.33 mg/kg，蜂王漿蜜膏中天冬氨酸含量最高為561.13 mg/kg。

表4 3種蜂產品中氨基酸組成Table 4 Contents of amino acids in three bee products

3 結論

本研究以BC為電泳緩沖液添加劑，提高毛細管電泳分離能力，構建基于蜂蜜中氨基酸組成的指紋圖譜分析方法。優化條件下，該方法能在25 min內實現17種氨基酸的基線分離，方法檢測限2.5×10-4μmol/L～30.0×10-4μmol/L。洋槐蜂蜜的加標回收率在81.10%以上，RSDs小于8.22%，證明所構建的方法是可靠的。該方法成功用于洋槐蜜、棗花蜜及蜂王漿蜜膏中氨基酸組成分析。結果表明，不同植物蜜源蜂蜜中氨基酸種類、含量存在明顯差異。該方法為天然蜂蜜質量控制提供新參考。

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