四環(huán)素膠體金免疫檢測技術的研究

栗慧，金艷丹，張巖蔚，魏東，*

（1.河北省農產品安全檢測重點實驗室，河北張家口075000；2.河北北方學院食品安全研究中心，河北張家口075000）

四環(huán)素（tetracycline，TC）是廣譜抗菌藥，由放線菌產生，具有殺菌作用，廣泛應用于畜禽類動物細菌病的治療，或用作畜禽類動物的生長促進劑[1]，其作用機制在于藥物能特異性地與細菌核糖體30S亞基的A位置結合，阻止氨基酰－tRNA在該位上的聯(lián)結，從而抑制肽鏈的增長和影響細菌蛋白質的合成[2]。但研究發(fā)現，如果用藥量過多會造成動物源性食品中TC殘留，能夠引起食用者毒性反應主要是表現在對胃、腸、肝臟的損害，以及牙齒的染色，還會造成過敏反應、二重感染、致畸胎作用[3-4]。因此，我國農業(yè)部于2002年12月24日規(guī)定了四環(huán)素在各種動源性食品中的使用限量。牛/羊奶中四環(huán)素類抗生素的總量不得超過100 ng/kg，所有食品動物的腎臟、肝臟及肌肉中分別不得超過600、300 ng/kg及100 ng/kg，禽蛋中不得超過200 ng/kg，魚/蝦的肉中不得超過100 ng/kg[5]。由于利益的驅動，部分養(yǎng)殖企業(yè)仍發(fā)生畜禽類動物體內TC含量超標事件，從而造成對消費者的傷害。為了減少動物源性食品中TC殘留對人體的傷害，必須要采用相應的檢測措施。目前的檢測方法主要是液相色譜-質譜聯(lián)用（LC-MS）、高效液相色譜（HPLC）以及毛細管電泳法（CE）等，但這些方法操作繁瑣、專業(yè)性強、儀器價格昂貴、不能普及[6-11]。因此，迫切需要建立一種精確、高效、經濟的檢測手段。

膠體金試紙條是近年興起的一種快速檢測新技術，是在酶聯(lián)免疫技術和層析技術相結合的基礎上發(fā)展起來的一種固相標記免疫測定新技術，具有小而便攜、不需儀器設備輔助、操作非常簡單、用肉眼即能判斷結果等諸多優(yōu)點，非常適用于食品的現場快速檢測[12-15]，已在臨床診斷中得到了廣泛應用，目前已開始應用于小分子物質的檢測，如毒素、藥物殘留、環(huán)境監(jiān)測等非臨床檢測領域。

納米級膠體金顆粒的制備及抗體的標記是膠體金免疫層析技術的關鍵，直接關系到建立的檢測方法的性能優(yōu)劣[16]。本試驗采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；TC多克隆抗體與已制備好的膠體金溶液進行標記。為以后裝配TC膠體金試紙條奠定了基礎，為TC在食品樣品中的快速檢測方法的建立提供理論參考。

1 材料

1.1 主要藥品及試劑

氯金酸：國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉、碳酸鉀：天津市永大化學試劑有限公司；檸檬酸三鈉：阿拉丁化學品有限公司；HRP標記的羊抗鼠IgG：北京中杉金橋生物技術有限公司；四環(huán)素多克隆抗體：河北北方學院實驗室自制。

1.2 主要儀器

電子天平：北京賽多利斯儀器系列有限公司；恒溫磁力攪拌器（JB-2型）：上海雷磁新經儀器有限公司；紫外-可見分光光度計（Lambda365）：鉑金埃爾默儀器有限公司；超聲波清洗器（KQ-500B型）：昆山市超聲儀器有限公司；干燥箱（FX101-3）：上海樹立儀器儀表有限公司；超純水機（Milli-Q Reference）：美國熱電公司。

2 方法

2.1 膠體金制備前處理

試驗所需所有玻璃器具均用超聲波清洗器進行清洗30 min，用蒸餾水、超純水依次沖洗，烘干；將所有器具放入酸缸中浸泡過夜，取出后用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水、超純水依次浸泡沖洗，烘干備用。

2.2 膠體金制備

采用檸檬酸三鈉還原法：

1）將裝有100 mL 0.01%氯金酸溶液的錐形瓶放在磁力攪拌器上邊攪拌邊加熱，直至沸騰。

2）沸騰后迅速加入1.8 mL 1%檸檬酸三鈉，顏色發(fā)生變化后繼續(xù)加熱15 min。

3）加熱完成后，待溶液冷卻至室溫，將體積恢復至原體積。

2.3 膠體金的鑒定

1）用肉眼觀察：通過肉眼觀察膠體金溶液的顏色、狀態(tài)，進行初步的鑒定。

2）可見光光譜法：使用紫外-可見分光光度計對膠體金在400 nm～700 nm波長范圍內進行掃描，得到膠體金的可見光吸收光譜，對膠體金的質量進一步的鑒定。

2.4 膠體金標記抗體

1）將裝有1 mL膠體金溶液的離心管中加入一定量的0.25 mol/L K2CO3調節(jié)pH值，獲得溶液A。

2）將四環(huán)素多克隆抗體稀釋，加入到溶液A中，攪拌反應30 min，獲得溶液B。

3）向溶液 B 中加入 100 μL 10%NaCl，攪拌反應30 min。

2.5 標記最適pH值的確定

將裝有1mL膠體金溶液的離心管中加入0.25mol/L K2CO3調節(jié) pH 值分別為 5、6、7、8、9、10，其他條件均相同。加入稀釋的四環(huán)素抗體，攪拌反應30 min，再加入100 μL 10%NaCl，攪拌反應30 min。根據金標抗體顏色變化及OD值選擇最適pH值。

2.6 標記最佳蛋白量的確定

將裝有1mL膠體金溶液的離心管中加入0.25mol/L K2CO3調節(jié)pH值。加入稀釋四環(huán)素抗體的5 000倍、6 000倍、7 000倍、8 000倍、9 000倍、10 000倍，攪拌反應30 min，其他條件均相同。再加入100 μL 10%NaCl，攪拌反應30 min。根據金標抗體顏色變化選擇最佳蛋白加入量。

2.7 膠體金標記抗體（金標抗體）活性鑒定

將羊抗鼠二抗用PBS稀釋50倍后，與制備好的金標抗體共同點樣于硝酸纖維素膜（NC膜）上，觀察顯色結果，鑒定金標抗體是否標記成功。

使用紫外-可見分光光度計對膠體金在400 nm～700 nm波長范圍內進行掃描，得到金標抗體的可見光吸收光譜，對金標抗體活性進一步鑒定。

3 結果與分析

3.1 膠體金的質量鑒定

膠體金的質量鑒定結果如圖1。

圖1 膠體金樣品Fig.1 Colloidal gold

通過肉眼觀察，制備的膠體金溶液，顏色呈現紫紅色、透亮、無雜質，狀態(tài)穩(wěn)定。

用紫外-可見分光光度計對制備的膠體金溶液進行掃描，在波長范圍是400 nm～700 nm內，得到如圖2所示的吸收光譜圖。

圖2 膠體金可見光光譜圖Fig.2 The visible spectra of colloidal gold

由圖2可知，最大吸收峰為524 nm，OD值為1.010 2，峰寬較小，波形平滑，證明制備的膠體金顆粒大小均，分布均勻。

3.2 標記最適pH值的確定

膠體金對蛋白的吸附主要因素在于pH值，圖3中所示為不同pH值對標記結果的影響，從左至右pH值依次增大。

圖3 不同pH值對金標抗體的影響Fig.3 The impact of prestige antibody at different pH

1號管為膠體金溶液，經pH試紙條測試為酸性，pH在5左右，向其直接加入抗體后，顏色變?yōu)榻咏咨?號管為膠體金溶液及4 μL K2CO3，經pH試紙條測試為酸性，pH在6左右，向其直接加入抗體后，顏色變?yōu)榈凵?號管為膠體金溶液及8 μL K2CO3，經pH試紙條測試為中性，pH在7左右，向其直接加入抗體后，顏色不發(fā)生變化；4號管為膠體金溶液及12 μL K2CO3，經pH試紙條測試為堿性，pH在8左右，向其直接加入抗體后，顏色不發(fā)生變化；5號管為膠體金溶液及16 μL K2CO3，經pH試紙條測試為堿性，pH在9左右，向其直接加入抗體后，顏色略發(fā)生變化；6號管為膠體金溶液及20 μL K2CO3，經pH試紙條測試為堿性，pH在10左右，向其直接加入抗體后，顏色進一步加深。通過觀察顏色的變化，可知1、2、5、6號管的pH值不適合膠體金標記抗體蛋白，3、4號管的pH值適合膠體金標記抗體蛋白。

根據上述試驗結果，進一步確定最佳pH值需要K2CO3的用量，設計7組試驗，每毫升膠體金溶液中添加 K2CO3用量分別是：0、5、8、9、10、11、12 μL。根據上述用量標記蛋白的OD值如圖4所示。

圖4 最佳標記pH值選擇Fig.4 Best mark pH value selection

由圖4可知，隨著K2CO3添加量的增加，金標抗體的OD值也隨之增加，當K2CO3的添加量達到9 μL之后，曲線趨于平緩。本試驗選擇每毫升金標溶液中添加 0.25 mol/L K2CO39 μL。

3.3 標記最佳蛋白量的確定

標記最佳蛋白量的選擇的結果見圖5。

圖5 標記最佳蛋白量的選擇Fig.5 Selection of labeled optimum protein

如圖5所示試驗結果，從左到右稀釋倍數依次增加，表明抗體含量依次減少，管中的液體顏色也發(fā)生不同程度的變化，4、5、6號管中液體顏色依次加深，2、3號管中液體顏色沒有變化，1號管中明顯抗體量過剩。基于在顏色不變時所用抗體含量的基礎上增加20%即為穩(wěn)定1 mL膠體金實際所需要的抗體量，本試驗選擇將抗體稀釋6 000倍。

3.4 金標抗體活性鑒定

金標抗體活性鑒定結果如圖6。

圖6 金標抗體活性的確定Fig.6 To determine the gold labeled antibody activity

羊抗鼠二抗與金標抗體作用后，NC膜上有明顯的紅色斑點，表明四環(huán)素多克隆抗體與膠體金成功標記。

金標抗體可見光光譜圖見圖7。

圖7 金標抗體可見光光譜圖Fig.7 Gold labeled antibody visible light spectrogram

由圖7可知，膠體金最大吸收峰所在波長為524nm，OD值為1.010 2。金標抗體最大吸收峰所在波長為528 nm，OD值為1.024 1。膠體金標記抗體的過程中最大吸收峰所在波長發(fā)生了偏移，說明其中物質的分子組成及空間構型發(fā)生了變化。由此表明膠體金標記抗體成功。

4 結論

膠體金的制備方法有檸檬酸三鈉還原法、抗壞血酸還原法、硼氫化鈉還原法、檸檬酸三鈉-鞣酸法等[17-19]。本試驗采用的制備方法是檸檬酸三鈉還原法，通過肉眼觀察及可見光光譜掃描法可知制備出的膠體金溶液顏色呈現紫紅色，狀態(tài)穩(wěn)定，峰寬較小，波形平滑。由此表明膠體金制備成功，根據Li J S等[20]研究表明膠體金粒徑在10 nm～70 nm最大吸收峰與粒徑之間存在線性關系：Y=0.427 1X+514.56，式中：Y為最大吸收峰；X為膠體金粒徑。由該公式可得膠體金粒徑為22.1 nm，屬于比較合適與抗體蛋白標記的粒徑。

膠體金溶液標記四環(huán)素抗體通過與羊抗鼠二抗反應和可見光光譜掃描法表明標記成功，優(yōu)化標記條件，選用最佳標記pH值為7.5左右，即需要添加9 μL 0.25 mol/L K2CO3調節(jié)pH值；最佳蛋白添加量為抗體稀釋6 000倍。膠體金的制備與標記成功為四環(huán)素膠體金試紙條的研制奠定了基礎。

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