響應面法優化生姜蛋白酶活性測定方法

侯嬰惠，張秀娟，王帥，唐曉珍，*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安271000；2.濟寧學院，山東曲阜273100）

酶作為一種生物催化劑，能夠通過降低從底物到產物的反應活化能，在溫和環境條件下提高反應速度[1-2]，因為酶具有催化高效性、底物專一性等優勢，使其在食品、工業、醫藥、分子生物學等領域具有越來越廣泛的應用[3-4]。目前在食品工業中開發利用的植物蛋白酶主要有木瓜蛋白酶[5]、菠蘿蛋白酶[6-8]、無花果蛋白酶[9-11]以及相對研究較晚較弱的生姜蛋白酶[12-13]等，這些植物蛋白酶結構與性質均相似。生姜酶活測定常參照木瓜蛋白酶活性測定標準，但實際試驗中因生姜蛋白酶與木瓜蛋白酶并非完全相同，具體反應溫度、時間等條件尚不統一，不能完全參照木瓜蛋白酶標準進行測定[14]。近年來關于生姜蛋白酶的研究雖多有報道，但生姜酶活性具體測定條件尚未統一。宋琦等[13]以酪蛋白為底物，單位時間內以生姜蛋白酶分解酪蛋白的生成物的量來表示酶活大小，此過程以需要加三氯乙酸等強酸終止反應；周慧等[15]采用考馬斯亮藍法測定單位時間內生姜蛋白酶分解酪蛋白后溶液殘留蛋白，以此為指標確定酶活大小，但此方法受溶液中雜質影響較大，所測結果真實性有待考究；于潔等[16]以加熱生姜蛋白酶失活后樣液為對照，以考馬斯亮藍法直接測出蛋白酶活性，但具體工藝條件有待篩選。因此建立快速、準確的生姜酶活測定方法非常重要。介于響應面試驗[17-19]周期短，回歸方程精確度高，能研究多因素間交互作用等優點[20-23]，本試驗以生姜蛋白酶活性為指標，通過單因素試驗，篩選出主要影響因素，再進行響應面試驗設計，從而優化了生姜蛋白酶活性測定工藝條件，為后續姜酶提取、純化提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生姜蛋白酶：實驗室提取；干酪素、三氯乙酸：天津市博迪化工有限公司；半胱氨酸、BSA（牛血清白蛋白）：北京索萊寶有限公司；考馬斯亮藍G-250：天津市凱通化學試劑有限公司提供；其他試劑均為實驗室常規試劑。

1.2 試驗儀器

UV-5500型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋HH-4：上海梅香儀器有限公司；離心機TDL-40B：上海安亭科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 生姜蛋白酶的制備

生姜洗凈切碎，稱取200 g，按1∶3（g/mL）料液比打漿，低溫（4℃）靜置2 h，離心取沉淀用磷酸緩沖液1 ∶4（g/mL）復溶，低速攪拌 15 min后再靜置 3 h，用四層紗布過濾后離心取上清液，加95%的乙醇至醇體積為60%，冰浴7 h離心取沉淀[24]。

1.3.2 蛋白質含量的測定

本試驗采用考馬斯亮藍法測蛋白質含量[25]。標準曲線為：y=0.019 3x-0.018 7，R2=0.999 4，式中：x 為蛋白質濃度，μg/mL；y為吸光度值。

1.3.3 生姜蛋白酶酶活力測定

生姜蛋白酶酶活測定條件：40℃水浴條件下，酶促反應15 min降解酪蛋白產生TCA可溶的多肽增加量，以滅活的生姜蛋白酶為對照[22]，根據酪氨酸標準曲線，測得樣品中酶活力大小。酶活力標準曲線為：y=774.11x-8.590 1，R2=0.999，式中：x 為樣品吸光度；y 為酶活力，U。

1.3.4 生姜蛋白酶酶活測定單因素試驗

生姜蛋白酶活性測定各單因素梯度設置：反應溫度 20、30、40、50、60、70℃；反應時間 1、3、5、7、9、11 min；酪蛋白底物濃度0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%；磷酸鹽緩沖液 pH5、5.5、6、6.5、7、7.5。

1.3.5 響應面法優化提取條件

在單因素的基礎上采用Design-Expert 8.0.6軟件進行四因素三水平試驗設計，以生姜蛋白酶酶活為響應值進行回歸分析，建立二次回歸模型，擬合得到二次回歸方程。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 反應溫度對酶活性測定的影響

反應溫度對生姜蛋白酶活性測定的影響見圖1。

圖1 反應溫度對生姜蛋白酶活性測定的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on the activity of Ginger protease

控制酶活測定時間5 min，酪蛋白濃度0.6%，緩沖液pH6.5，考察溫度在20℃～80℃時酶活大小。在一定溫度下酶具有最大活性，此溫度稱為酶的最適溫度[8]。由圖1可知，隨著溫度的升高酶活增大，在溫度為40℃時酶活測定值最大。當溫度大于40℃時，隨著溫度升高酶活性逐漸降低趨于0，此時酶已失活變性[13]。所以，選擇反應溫度為40℃。

2.1.2 反應時間對酶活性測定的影響

反應時間對生姜蛋白酶活性測定的影響見圖2。

圖2 反應時間對生姜蛋白酶活性測定的影響Fig.2 Effect of reaction time on the activity of Ginger protease

控制酶活測定反應溫度40℃，酪蛋白濃度0.6%，緩沖液pH6.5，考察反應時間在1 min～11 min時酶活大小。由圖2可知，隨著反應時間的延長，酶活先增大后降低，反應時間5 min時酶活測定值最大。隨著反應時間繼續增大，酶活緩慢降低，是因為5 min時酶已充分參與反應，隨著時間的增大，酶在40℃的水浴條件下逐漸失活。所以，選擇反應時間為5 min。

2.1.3 底物濃度對酶活性測定的影響

底物濃度對生姜蛋白酶活性測定的影響見圖3。

圖3 底物濃度對生姜蛋白酶活性測定的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the activity of Ginger protease

控制酶活測定反應溫度40℃，反應時間5 min，緩沖液pH6.5，考察酪蛋白底物濃度在0.3%～1.8%時酶活大小。由圖3可知，在反應溫度、緩沖液pH值適宜的條件下，酶促反應隨底物濃度的增大迅速增大，當底物濃度大于0.9%時，底物濃度繼續增大，酶活性中心分子逐漸被飽和，反應速度的增加率將會減少[26]。所以，選擇酪蛋白濃度為0.9%。

2.1.4 緩沖液pH值對酶活性測定的影響

緩沖液pH值對生姜蛋白酶活性測定的影響見圖4。

圖4 緩沖液pH值對生姜蛋白酶活性測定的影響Fig.4 Effect of buffer pH on the activity of Ginger protease

控制酶活測定反應溫度40℃，反應時間5 min，酪蛋白濃度0.9%，考察緩沖液pH值在5～7.5時酶活大小。由圖4可知，隨著緩沖液pH值的增大，酶活先增大后降低。pH值之所以影響酶的活性是因為緩沖液pH值改變了酶活性部位相關的基團的解離狀態[13]，當緩沖液pH6.5時酶活最大，此時酶分子上活性基團的解離狀態最適于酶與底物結合；當pH值大于7.5時酶活性突然降低，其原因為過堿使蛋白質中的氫鍵、化學鍵斷裂或與游離的氨基或羧基形成鹽，從而使蛋白質變性[16]。所以，選擇緩沖液為pH6.5。

2.2 響應面法分析

2.2.1 響應面優化生姜蛋白酶酶活測定條件

根據單因素試驗結果篩選出反應時間、反應溫度、底物濃度、緩沖液pH值作為優化條件，應用Design-Expert 8.0.6軟件設計四因素三水平的響應面試驗，利用響應面試驗結果確定生姜蛋白酶酶活測定最佳方案。響應面試驗因素水平表如表1，試驗結果如表2所示。

表1 因素水平表編碼表Table 1 Factors and levels in central composite design

表2 響應面分析方案與試驗結果Table 2 Experimental scheme and results of central composite design

根據表1設定的水平和因素，以A（反應時間）、B（反應溫度）、C（底物濃度）、D（緩沖液pH值）為自變量，酶活（Y）為響應值，按表2實施30次試驗，并測得各條件下的酶活。所得回歸方程為：

酶活=-2 444.190 99+84.668 55A-2.676 57B+482.823 24C+665.213 34D-0.223 58AB+1.657 38AC-7.544 74AD+0.433 75BC+3.032 71BD-13.271 33CD-3.427 20A2-0.188 38B2-221.162 64C2-56.497 05D2

式中：Y 為酶活預測值；A、B、C、D 為上述 4個自變量的編碼值。

2.2.2 方差分析及顯著性檢驗

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，進行顯著性檢驗。得到的回歸方程的顯著性檢驗及方差分析結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation for the yield of xylan

P值的大小表明模型及各考察因素的顯著水平。P值小于0.05，表明模型或各因素有顯著影響；P值小于0.01，表明模型或各因素高度顯著。從表3可知，以酶活為響應值時，模型P＜0.010 0，表明該二次方程模型極顯著。同時失擬項P=0.133 1＞0.100 0，表示正交試驗結果和數學模型擬合良好，即可用該數學模型推測試驗結果。由表3還可以看出，4個因素中A、B、C影響極顯著，AD、BD、A2、B2、C2、D2影響極顯著，D、AB、AC、BC、CD、影響差異不顯著，其結果表明在酶活測定時，反應時間、溫度、底物濃度均對測定結果有較大影響。雖然過酸或過堿性條件可使蛋白變性，但在響應面試驗過程中溶液緩沖液pH值均在7左右，因此測定結果表明D緩沖液pH對酶活測定影響不顯著。

2.2.3 響應面分析及酶活測定工藝優化

響應面交互作用分析與優化通過Design Expert8.0.6軟件對各因素之間的交互作用進行響應面分析，繪制響應面曲線圖。圖5分別顯示6組以酶活為響應值的趨勢圖。從其等高線圖可直觀反映出2個變量間交互作用的顯著程度，其中圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示兩因素交互作用顯著。

由圖5響應面立體圖和等高線圖形可知：反應時間、反應溫度、底物濃度、反應時間和緩沖液pH值、反應溫度和緩沖液pH值交互作用對酶活測定影響均顯著；圖5D、5F中等高線圖形趨于圓形，反應溫度和底物濃度、底物濃度和緩沖液pH值交互作用不顯著。

圖5E（a）響應面隨著pH值的增大酶活先增大后降低，變化幅度較小；隨溫度的增大酶活先增大后降低且變化幅度較大。這主要是由于較高或較低的pH值使蛋白質氫鍵斷裂引起酶變性失活；適當提高酶活測定溫度可提高酶催化活性，當溫度高于酶活反應最佳溫度時，測定溫度越大酶易變性失活[13]。因此酶活測定時要選擇合適的緩沖液pH值及測定溫度。

圖5 兩因素交互作用對生姜蛋白酶活測定的等高線和響應面Fig.5 Response surface and contour plots showing two factors effects on the activity of Ginger protease

由各響應面立體圖可看出，響應值存在最大值。通過軟件分析計算得出理論最佳提取工藝：反應時間3.6 min，反應溫度46.45℃，底物濃度0.95%，緩沖液pH6.78，其預測值為130.46 U。為檢驗響應面優化結果的可靠性，采用上述條件測定酶活為133.15 U，表明該試驗值與預測值吻合良好。

3 結論

采用Design-Expert 8.0.6軟件的中心組合設計方法設計響應面試驗，建立數學模型。方差分析結果表明反應溫度和時間、反應溫度和底物濃度、反應溫度和緩沖液pH值、反應時間和底物濃度的交互作用對酶活測定影響均顯著，反應時間和緩沖液pH、底物濃度和緩沖液pH交互作用不顯著。通過軟件分析得出生姜蛋白酶活性測定最佳條件：反應時間3.6 min，反應溫度46.44℃，底物濃度0.95%，緩沖液pH6.78，此條件下生姜蛋白酶活130.46 U，驗證試驗測得生姜蛋白酶活性為133.15 U，與預測值吻合。

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