蒲公英提取物中總酚酸含量測定方法的優化

張艷，余正勇，耿福能，吳桃清，楊亮，肖懷，3，趙昱，3，劉衡，3，*

（1.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理671000；2.藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心，云南大理671000；3.中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發利用協同創新中心，云南大理671000；4.四川好醫生藥業集團，四川成都610000）

蒲公英又名婆婆丁、黃花地丁等，為菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.、堿地蒲公英Taraxacum borealisinense Kitag.或同屬數種植物的干燥全草[1]，其性味苦、甘、寒，歸肝、胃經，具有清熱解毒、消腫散結、利尿通淋的功效，常用于治療疔瘡腫毒、乳癰、腸癰和熱淋澀痛等癥[1]，具有較高營養價值、藥用保健作用效果明顯和綠色無公害的特點[2]，國內外已開發出了一系列的藥品、保健品和化妝品[3]。蒲公英作為一種食藥兩用的植物，營養成分豐富，主要有黃酮類、酚酸類、三萜類、多糖類等[4-6]，其中VC和VB2的含量均高于日常食用的蔬菜，礦質元素的含量也較高[7]，還含有抗腫瘤活性元素——硒[8]。研究表明，蒲公英中的酚酸類物質具有抗病毒、抗炎、抗菌、提高免疫力、抗氧化、清除自由基的作用[9]。因此測定蒲公英中總酚酸含量對其質量品質的評價以及進行深入研究藥物作用機理有重要意義。本試驗采用三氯化鐵-鐵氰化鉀比色法（普魯士藍比色法）[10-12]，以咖啡酸為對照品測定蒲公英提取物中總酚酸的含量，并對該法顯色條件進行優化，為蒲公英營養價值和藥用價值的進一步加工利用提供依據。

1 材料與儀器

1.1 儀器

BSA124S分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司；UV-6000PC紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；AKSW-V-16艾柯實驗室超純水機：成都艾柯水處理設備有限公司；ZLG-5中藥浸膏噴霧干燥機：常州一步干燥設備有限公司；酒精計：武強縣滏陽儀表廠。

1.2 試劑

咖啡酸標準品（批號：110885-200102）：中國食品藥品檢定研究院；三氯化鐵（批號：20140705）、鐵氰化鉀（批號：20140602）：天津市風船化學試劑有限公司，AR；十二烷基硫酸鈉（批號：201406）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，AR；鹽酸（批號：20120629）：汕滇藥業有限公司，AR；95%乙醇（批號：20160818）：天津市福成化學試劑廠，AR。

1.3 材料

蒲公英：云南大理市金貝中藥材市場，大理大學昆蟲生物醫藥研究院何苗老師鑒定為藥用蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.。

2 方法

2.1 蒲公英提取物制備工藝流程

取干燥、粉碎的蒲公英適量，加10倍量的水，微沸提取2 h，提取2次，過濾，合并濾液，濃縮至比重為1.08～1.10時攪拌并緩慢加入90%的乙醇，使溶液含醇量達到60%，持續緩慢攪拌1 h，4℃靜置24 h，過濾，濾液濃縮至比重為1.08～1.10時噴霧干燥，即得蒲公英提取物。連續制備三批蒲公英提取物，批號：170110、170111、170112。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

精密稱取蒲公英提取物4.0 mg置10 mL量瓶中，加入70%的乙醇超聲溶解，定容，即得供試品溶液。

2.2.2 咖啡酸標準品溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的咖啡酸標準品5.0 mg，置50 mL棕色量瓶中，加入70%乙醇溶解，定容，即得100 μg/mL的咖啡酸標準品溶液。

2.3 測定波長的確定

精密量取標準品溶液和供試品溶液各1.0 mL于25 mL棕色量瓶中，加70%乙醇至5.0 mL，分別加入0.3%SDS溶液2.0 mL，0.6%三氯化鐵與0.9%鐵氰化鉀（體積比為1∶1）混合溶液2.0 mL，暗處放置5 min，加0.1 mol/L的鹽酸溶液至刻度，暗處放置20 min，以70%乙醇溶液代替咖啡酸為空白對照，于400 nm～800 nm波長下掃描，并記錄結果，見圖1。由此可知，最大吸收波長為764 nm。

圖1 咖啡酸及供試品光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of caffeic acid and sample

2.4 咖啡酸標準曲線的制備

精密量取標準品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25 mL棕色量瓶中，補加70%乙醇至5.0 mL，分別加入0.3%SDS溶液2.0 mL，0.6%三氯化鐵與0.9%鐵氰化鉀（體積比為1∶1）混合溶液2.0 mL，暗處放置5 min，加0.1 mol/L的鹽酸溶液至刻度，暗處放置20 min，以不含咖啡酸標準品溶液的空白溶劑為對照，于764 nm波長下測定吸光度值。以咖啡酸濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸分析。

2.5 供試品分析

精密量取供試品溶液1.0 mL于25 mL棕色量瓶中，加70%乙醇至5.0 mL，照標準曲線的制備項下的方法，自精密加入0.3%SDS溶液2.0 mL起，依法測定吸光度值，從標準曲線上讀出供試品溶液中含咖啡酸的濃度，計算，即得。

3 結果與分析

3.1 顯色時間的影響

供試品分析中，其他操作不變，定容后，在764 nm波長下測定吸光度值，每隔10分鐘測定一次，至80min，測定結果見圖2。供試品溶液在顯色20 min后，吸光度值趨于穩定，故確定顯色時間為20 min。

圖2 顯色時間的影響Fig.2 Effect of coloration time

3.2 顯色劑用量的影響

供試品分析中，改變0.9%鐵氰化鉀與0.6%三氯化鐵（體積比為1∶1）混合溶液加入量分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，其余試劑加入量不變，同法測定吸光度值，平行測定3份，測定結果見圖3。

圖3 顯色劑用量的影響Fig.3 Effect of the dosage of chromogenic agent

由圖3可知，顯色劑加入量對吸光度影響較大，隨著顯色劑用量的增加，吸光度值先增加后趨于穩定，當顯色劑用量大于2.0 mL時，吸光度值基本無變化，所以最佳顯色劑用量確定為2.0 mL。

3.3 鹽酸濃度考察

供試品分析中，改變鹽酸濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.2 mol/L，其他操作不變，測定吸光度值，平行測定3份，測定結果見圖4。

由圖4可知，供試品溶液在加入鹽酸濃度為0.1mol/L時，吸光度值最大，故鹽酸濃度確定為0.1 mol/L。

3.4 SDS用量的影響

供試品分析中，改變0.3%SDS溶液溶液加入量為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，其他操作不變，測定吸光度值，平行測定3份，測定結果見圖5。

圖4 鹽酸濃度的影響Fig.4 Effect of he concentration of hydrochloric acid

圖5 SDS用量的影響Fig.5 Effect of the dosage of Sodium dodecyl sulfate（SDS）

由圖5可知，供試品溶液在加入SDS的量為2.0mL時，吸光度值較大，且穩定性較好，故確定SDS的用量為2.0 mL。

綜上所述：顯色劑用量為2.0 mL，鹽酸的濃度為0.1 mol/L，SDS溶液用量為2.0 mL，顯色時間為20 min，為蒲公英提取物中總酚酸含量測定的最佳顯色條件。

3.5 方法學考察

3.5.1 標準曲線的制備

根據“2.4”項下的方法，以咖啡酸濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，得線性方程為Y=0.191 2X+0.088 9，r=0.999 2，結果表明咖啡酸在2.0 μg/mL～20.0 μg/mL范圍內線性關系良好。標準曲線見圖6。

圖6 咖啡酸標準曲線Fig.6 Standard curve of Caffeic acid

3.5.2 精密度試驗

精密量取供試品溶液1.0 mL，按“2.4”項下顯色條件顯色，連續測定6次，并記錄吸光度。結果的RSD為0.03%，表明儀器精密度良好。

3.5.3 穩定性試驗

精密量取供試品溶液1.0 mL，按“2.4”項下顯色條件顯色，2 h內每隔5分鐘測定1次，并記錄吸光度。結果顯色60 min內的RSD為1.90%，表明供試品吸光度在60 min內基本穩定。

3.5.4 重復性試驗

精密量取供試品溶液1.0 mL，照“2.4”項下顯色條件顯色并測定，平行6份，記錄吸光度。結果的RSD為1.84%，表明方法重復性良好。

3.5.5 加樣回收試驗

精密稱定6份已知含量的蒲公英提取物4.0 mg于10 mL量瓶，精密加入“2.2”項下咖啡酸標準品5.0 mL，加入70%乙醇定容，精密量取1.0 mL，按“2.4”項下顯色條件顯色并測定，記錄吸光度，見表1，計算總酚酸的回收率。結果平均加樣回收率為98.86%，RSD為0.84%，說明該方法準確性好。

表1 加樣回收率試驗Table 1 Recovery of added samples test

3.6 樣品檢測與分析

分別取不同批號的蒲公英提取物6份，照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，分別取供試品溶液1.0 mL于25 mL量瓶中，自加70%乙醇至5.0 mL起，按“2.4”項下顯色條件顯色，以70%乙醇溶液代替供試品為空白，于764 nm波長下測定吸光度，見表2。由此可見，蒲公英提取物中總酚酸平均含量為120.5 mg/g。

表2 蒲公英提取物中總酚酸含量測定結果（n=6）Table 2 Contentdetermination of total phenolic acids in extract of Taraxacum mongolicum（n=6）

4 討論

植物總酚酸定量測定的方法較多，普遍使用的有普魯士藍法、Folin-酚法、亞硝酸鈉—硝酸鋁配位顯色法、紫外分光光度法等，而普魯士藍法與其他幾種方法相比靈敏度高，且采用該法溶液體系均一、線性良好[13]。采用該法測定總酚酸含量時，顯色條件對吸光度有較大影響，且溫度和外源光也有一定的影響，因此顯色條件需嚴格控制，并避光保存，定時測量才能保證結果的準確性。

供試品溶解時，采用甲醇溶液、50%甲醇溶液和95%乙醇溶液都不能完全溶解，有少許沉淀，而70%乙醇溶液基本能使供試品完全溶解，且使用70%乙醇溶液作溶劑時反應更加靈敏，穩定性也相對較好[11]，因此溶劑選用70%乙醇；本試驗還對加入酸的種類進行了考察，分別考察了0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L醋酸，結果表明加入鹽酸穩定性較醋酸好。

蒲公英中含有多種酚酸，其中包括咖啡酸[14]，故本試驗以咖啡酸為對照品建立了蒲公英總酚酸的含量測定方法。該方法操作簡單，準確度及精密度高，重復性和穩定性好，儀器普及率高，易于推廣等優點，可用于蒲公英提取物及制劑中總酚酸定量分析及質量控制，同時對某些藥材的總酚酸分析及質量控制有一定的參考價值。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社,2015:352-353

[2]趙磊,楊延杰,林多.蒲公英的經濟價值[J].遼寧農業科學,2006(6):33-35

[3]趙昱,劉衡,張成桂,等.藥用蒲公英產品的開發進展[J].國際藥學研究雜志,2012,39(4):311-314,344

[4]謝沈陽,楊曉源,丁章貴,等.蒲公英的化學成份及其藥理作用[J].天然產物研究與開發,2012(24):141-151

[5]孟志云,徐綏緒.蒲公英的化學與藥理[J].天然產物研究與開發,2012,24(S1):141-151

[6]施樹云.黑紫橐吾和蒙古蒲公英的化學成分研究及臭靈丹中異綠原酸的色譜制備研究[D].杭州:浙江大學,2007:41-61

[7]林春梅,周鳴謙.蒲公英飲料加工工藝研究[J].食品研究與開發,2013,34(21):47-50

[8]戴凌燕.多倍體蒲公英速凍及復水工藝研究[J].農產品加工學刊,2006(9):11-13

[9]閆曉慧,談鋒.3種松果菊屬植物的鑒別、活性成分及生物技術研究進展[J].中草藥,2006,37(2):300-303

[10]吳曉青,陳丹,邱紅鑫,等.芙蓉李中總多酚含量測定方法的優選[J].中國中醫藥科技,2011,18(2):131-133

[11]魏旭,冉小庫,李德偉,等.亞貢葉提取物中總酚酸的含量測定方法研究[J].遼寧中醫雜志,2015,42(4):811-814

[12]楊嵐,李華峰,刁海鵬,等.蒲公英花中總酚酸和總黃酮含量測定及其抗氧化性能研究[J].食品科學,2011,32(17):160-163

[13]楊雁芳,艾鐵民.紫外分光光度法測定松果菊提取物中多酚[J].中草藥,2005,36(11):1649-1650

[14]林文艷.蒲公英化學成分研究及板藍根HPLC指紋圖譜研究[D].杭州:浙江大學,2005:8-9