蛹蟲草口含片制備工藝及活性評價研究

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養與安全教育部重點實驗室，天津300457）

蛹蟲草又稱為北冬蟲夏草或北蟲草，它的拉丁學名為 Cordyceps militaris（L：Fr）link，是由子座（即草的部分）與菌核（即蟲尸體的部分）組成的復合體[1]。目前大多數蛹蟲草都是以蠶蛹為寄主，采用人工栽培而成型的，這種蛹蟲草具有一定的藥理作用，同時富含多種營養物質，是制作保健品較好的原材料[2]。隨著經濟技術的發展和生活節奏的加快，人們的工作學習壓力越來越大，很多人的免疫功能卻在減弱，身體處于一種亞健康狀態，免疫性疾病時有發生。蛹蟲草作為一種食藥兼用真菌，其有效成分如蟲草素、蟲草多糖等在醫療、食品、保健等方面都已證明具有顯著功效[3]。目前已有研究開發蛹蟲草的保健品，配方多以蛹蟲草粉末為主，食用時也是直接吞服，具有較強的砂礫感及土腥味，并未對口味等感官指標進行進一步的考察[4]。因此如何提高蛹蟲草提取物產品的口感及藥效具有一定的研究意義。

目前，提取蛹蟲草有限成分的方法有多種，如溶劑提取法、微波輔助提取、超聲提取法、酶提取法等。周國海等[5]采用水作為溶劑，提取蛹蟲草多糖，得到的提取純度較高。但如今溶劑提取在蛹蟲草子實體中運用較廣的主要是蛹蟲草多糖提取和蛹蟲草蟲草素、蟲草酸的提取，一般都是提取單一的活性成分；已有利用微波輔助酶法，對蛹蟲草基質多糖進行提取[6]但利用微波綜合提取蛹蟲草子實體的報道十分少；楚玉南等人[7]通過超聲波對蛹蟲草的總苷進行提取研究，超聲波的發射范圍受到一定的衰減因素的制約，對設備功率要求較高，同時產生噪音較大；超高壓技術不僅在加工方面具有獨特的優勢，近年來，超高壓在物質的有效成分提取方面具逐漸發揮特有的優勢。同時蛹蟲草子實體所含纖維含量較高，這也是影響對蛹蟲草內部活性成分提取率的原因，因此可以利用纖維素酶對蛹蟲草子實體中的細胞壁進行降解，使得包裹在纖維內的活性成分更好的溶出。目前，將超高壓協同酶解來提取蛹蟲草的有效成分并開發成產品的鮮有。

本文利用超高壓協同酶解所得蛹蟲草提取物作為原料，研究了蛹蟲草口含片的生產工藝及活性評價。為今后蛹蟲草有效成分的提取及口含片的加工提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗以人工培養的蛹蟲草（Cordyceps militaris）子實體：天津東方中濱農業科技有限公司提供（本文統稱蛹蟲草），經粉碎后過80目篩的蛹蟲草粉為原料。

蟲草酸：北京索萊寶科技有限公司；高碘酸鉀、無水葡萄糖、L-鼠李糖：天津市江天化工技術有限公司；纖維素酶：諾維信（中國）生物技術有限公司；檸檬酸：北京北方霞光食品添加劑有限公司；白砂糖：廣西南寧東亞糖業有限公司；淀粉：蘭溪鴻香生物科技有限公司；硬脂酸鎂：湖州市菱湖新望化學有限儀器與公司；所有輔料用試劑均為食品級。

1.2 設備

TGL-16B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；DZF-6020型真空干燥箱：上海益恒科技有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；HPP.L3超高壓設備：天津市紐森科技有限公司；SRJX-4-9馬弗爐：天津五金機電廠；K9840自動凱氏定氮儀：濟南能儀器有限公司；循環水真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器：上海華線醫用核子儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛹蟲草提取物口含片的加工工藝

1.3.1.1 口含片制備工藝流程

凈制蛹蟲草→干燥→粉碎→超高壓協同酶解提取→凍干→研磨→輔料混合→壓片→滅菌→包裝

1.3.1.2 蛹蟲草提取物功能成分測定

蛋白質含量測定：依據GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的自動凱氏定氮儀的方法測定蛹蟲草中蛋白質的含量[8]。

蟲草多糖含量的測定：采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[9-10]。

蟲草素、腺苷含量測定：采用高效液相色譜法測定蟲草素與腺苷含量[11-12]。

蟲草酸含量測定：采用比色法測定蟲草酸含量。

1.3.1.3 口含片制備操作要點

粉碎：將凈制后烘干的蛹蟲草通過粉碎機粉碎，過80目篩，備用。

提?。焊鶕覀円酝龅墓ぷ?，得到超高壓協同酶解的最佳條件進行提取。按固液比為1∶10（g/mL）的蛹蟲草子實體細粉與水相溶，然后裝入聚乙烯塑料袋中，真空包裝后浸泡于超高壓處理裝置的傳壓介質水中，進行超高壓處理，處理條件為400 MPa，8 min，后取出加入纖維素酶，按照料液比1∶10（g/mL），pH4.5，加酶量1 μL/mL，在50℃下提取4 h，75℃下滅活，在進行水提，提取條件為58℃，2 h，提取兩次，最后抽濾。

輔料混合：先將白砂糖，淀粉與提取物混合均與，再加入硬脂酸鎂，麥芽糊精和β環糊精。

壓片：將混合好的原料粉傾倒與壓片機中，進行壓片，去掉表面不光滑及有缺口的含片，使含片平均重量在0.25 g。

滅菌：壓好的含片送入紫外滅菌室，在紫外燈下滅菌30 min。

1.3.2 口含片輔料添加量的選擇

以淀粉及麥芽糊精為輔料，分別按2%、5%、10%、15%、20%的添加量添加蛹蟲草提取物；按照物料質量的5%、10%、15%、20%、25%的添加白砂糖，按照物料質量的2%、4%、6%、8%、10%的添加檸檬酸；使β-環糊精添加量設定為物料質量的2%、4%、6%、8%、10%；按照硬脂酸鎂添加量分別為為物料質量的0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%進行配比添加；淀粉和麥芽糊精作為最后的填充物料，添加的比例為3∶1、2 ∶1、1∶1、1∶2、1∶3（質量添加比）。以感官評價方法為評定指標，給出兩組評分（風味評分、總感官評分），得出最佳添加量。

1.3.3 蛹蟲草提取物口含片質量評價

1.3.3.1 蛹蟲草提取物口含片感官評價標準

蛹蟲草口含片的研制過程中，根據配料及壓片后成型的效果，對感官標準進行評定，通過選擇10個以上具有一定經驗及鑒別能力的教師和學生組成評定小組，進行感官評定，根據最終匯總統計，所得分值最高組的配比，將作為產品生產的參考配方，其評分的感官標準如表1。

表1 蛹蟲草口含片感官評分標準Table 1 Standard sensory score of Cordyceps militaris buccal tablets

1.3.3.2 蛹蟲草提取物口含片總灰分的測定

取0.25 g口含片樣品研細，置于己烘干至恒重的坩堝內，精密稱取重量后，至于電爐上燒至完全變黑并且無煙，在將坩堝移至馬弗爐內，升溫至500℃～600℃，保持1 h～2 h，使之完全灰化后取出到干燥器中放置至室溫，精密稱量并計算總灰分的含量（%），公式如下：

1.3.3.3 蛹蟲草提取物口含片水分的測定

取蛹蟲草提取物口含片5片，平鋪于已干燥至恒重的稱量瓶中，精密稱定，精確至0.001，后放在烘箱中在105℃進行干燥，首次干燥5小時，后稱重，再干燥，每隔1小時稱重，干燥時應將瓶蓋取下，取出時須將瓶蓋蓋好。記錄每次重量直至恒重（系指連續兩次干燥后的重量差異在5 mg以下），后計算水分含量，公式如下：

1.3.3.4 片劑硬度、片重差異、含化時間檢驗

片劑硬度的檢驗：取20片供試品，依次放入片劑硬度儀的樣品槽，手動壓片，讀取并記錄片劑破碎時的最大壓力，即為每片的片劑硬度。

片重差異的檢測：檢測時，先隨機取20片供試品于稱好重量的空稱量瓶中，稱其總重，計算平均片重，再精密稱定各片片劑的重量。根據中國藥典2005版一部附錄，0.3 g或0.3 g以上片劑的重量差異限度不得超過5%[13]。片重差異限度的計算公式如下：

含化時間的檢測：感官評定小組成員，記錄其每次入口含片及含片在口中消失的時間，每人含化口含片的時間，即為口含片的含化時間。

1.3.3.5 蛹蟲草提取物口含片相關質量評價標準

菌落總數的測定參照GB 4789.2-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》；大腸桿菌含量的測定參照GB 4789.3-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》；鉛元素的測定參照GB 5009.12-2010《食品安全國家標準食品中鉛的測定》，汞元素的測定參照GB 5009.17-2014《食品安全國家標準食品中總汞及有機汞的測定》，砷元素的測定參照GB 5009.11-2014《食品安全國家標準食品中總砷及無機砷的測定》[14-18]。

1.3.4 蛹蟲草提取物口含片的免疫學實驗

將實驗所用小鼠（選擇昆明雌性小鼠）隨機分為4組：正常對照組（生理鹽水）、低劑量組（2 000 mg/kg·bw）、中劑量組（4 000 mg/kg·bw）、高劑量組（6 000 mg/kg·bw），每組10只。采用灌胃方式給藥，給藥量為0.2 mL/10 g，每天給藥1次，連續給藥21 d。

1.3.4.1 胸腺指數和脾臟指數的測定

小鼠末次給藥后2 h，記錄小鼠體重并摘除眼球處死，將小鼠置于75%酒精中浸泡片刻，將小鼠仰位固定進行剖檢，摘取脾臟、胸腺，在生理鹽水中清洗、修剪，去除脂肪及筋膜，濾紙上濾干后稱其濕重。臟器重量與體重之比，按下列公式計算[19]：

式中：m1為脾臟重量，mg；m2為胸腺重量，mg；M為體重，g。

1.3.4.2 小鼠碳粒廓清實驗

根據文獻[19]設計實驗。

末天灌胃2 h后，將小鼠稱重并記錄體重，按體重系數0.1 mL/10 g從小鼠尾靜脈注入用PBS∶墨汁=4∶1（體積比）稀釋的印度墨汁，分別在注入墨汁后2 min（t1）、10 min（t2），從內眥靜脈叢取血 20 μL，并立即加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，混勻。用分光光度計在600 nm處測吸光度值（OD），以0.1%Na2CO3溶液做空白調零，分別用OD1和OD2來表示2 min和10 min所取血樣的吸光度值。將小鼠處死，解剖動物，取出肝臟、脾臟及胸腺，除去表面脂肪等組織，用濾紙吸干血跡后稱重。小鼠的碳粒廓清指數K、吞噬指數α的計算公式如下：

式中：t1、t2為注射印度墨汁后采血的時間；OD1為t1時取血清測得的吸光度值；OD2為t2時取血清測得的吸光度值；m為小鼠體重，g；M0為肝脾合重，g。

1.3.4.3 小鼠脾淋巴細胞增殖實驗

根據文獻[20-21]設計實驗。

小鼠連續灌胃21天后，將小鼠摘眼球取血、處死。無菌取脾，將脾臟置于盛有適量Hank’s液的平皿中，將脾臟處理干凈后置于200目網篩上輕輕碾壓，使用適量Hank’s液沖洗鋼網篩，得到單細胞懸液，吸取置于15 mL離心管中。1 000 r/min離心10 min，棄上清，將細胞用適量Hank’s液吹勻、離心洗滌，2次～3次，至洗滌至細胞呈白色，用RPMI-1640完全培養基稀釋細胞，采用臺盼藍拒染法計數活細胞數（活細胞數在95%以上），調整細胞濃度2×107個/mL。將細胞懸液加入96孔板中，每孔100 μL，空白對照加入100 μL RPMI-1640完全培養基，ConA刺激組加入100 μL終濃度為 5 μg/mL的 ConA溶液，LPS刺激組加入 100 μL終濃度為10 μg/mL的LPS溶液，每組3個平行孔。將96孔板置于5%，CO2培養箱中，培養44 h后，采用MTT 法[22]，每孔加入 5 mg/mL MTT 溶液 20 μL，繼續培養4 h。培養結束后，1 000 r/min離心10 min，棄上清，每孔加入150 μL的DMSO溶液，輕輕震蕩待紫色結晶紫溶解后，用酶標儀在570 nm波長測定光密度值。用實驗孔與對照孔光密度值的比值表示脾細胞的增值能力，計算公式如下：

式中：SIConA為ConA刺激指數；SILPS為LPS刺激指數；OD1為ConA實驗組吸光度值；OD2為LPS實驗組吸光度值；OD3為對照組吸光度值。

2 結果與分析

2.1 超高壓協同酶解輔助提取蛹蟲草提取物活性成分分析

蛋白質含量22.14%，蟲草多糖含量28.83%，蟲草素含量0.616%，腺苷含量0.174%，蟲草酸含量0.897 8%。超高壓協同酶解輔助提取工藝可以較大的提高蛹蟲草的提取率及活性成分的含量，因此以超高壓協同酶解輔助提取制備蛹蟲草提取物進行口含片開發。

2.2 蛹蟲草提取物口含片工藝結果

2.2.1 蛹蟲草提取物口含片配方確定

2.2.1.1 蛹蟲草提取物添加量的選擇

以淀粉及麥芽糊精為輔料，添加蛹蟲草提取物，所得感官評價如下表2所示。

表2 蛹蟲草提取物添加量的感官評分表Table 2 Sensory value varying with the concentration of Cordyceps malitaris extractive

由表2可知，當提取物添加量在10%時，不論是風味還是感官總分值，都是比較好的，因此工藝中，蛹蟲草提取物添加量定為10%。

2.2.1.2 白砂糖與檸檬酸添加量的考察

白砂糖添加量的感官評分表見表3。

表3 白砂糖添加量的感官評分表Table 3 Sensory value varying with the concentration of white sugar

由表3可以看出，口含片甜味較重還是比較得到大家的喜歡，在風味評價上可以看出，由于蛹蟲草口味較鮮，與糖的甜味組合，可以提升鮮味，當糖的添加量在20%、25%時，風味評分較高。由表2（c）可以看出，檸檬酸的添加量在6%時評分較高，與甜味劑相匹配，達到一個較好的口感，選擇糖含量在15%，檸檬酸含量為6%進行配比。

檸檬酸添加量的感官評分表見表4。

表4 檸檬酸添加量的感官評分表Table 4 Sensory value varying with the concentration of citric acid

2.2.1.3 β-環糊精加量的考察

β-環糊精添加量的感官評分表見表5。

表5 β-環糊精添加量的感官評分表Table 5 Sensory value varying with the concentration of βcyclodextrin

根據感官試驗結果，可以看出當β-環糊精添加量為6%和8%時，感官總分值相差不大，因此繼續考察后期壓片的條件，根據壓片后成片的硬度，選擇8%的添加量為口含片的配方。

2.2.1.4 硬脂酸鎂添加量的考察

硬脂酸鎂添加量的感官評分表見表6。

表6 硬脂酸鎂添加量的感官評分表Table 6 Sensory value varying with the concentration of magnesium stearate

由表6可以看出當硬脂酸鎂添加量在6%時，組織狀態評分較高。

2.2.1.5 淀粉和麥芽糊精添加量的考察

淀粉和麥芽糊精添加比例的感官評分表見表7。

表7 淀粉和麥芽糊精添加比例的感官評分表Table 7 Sensory value varying with the ratio of starch and maltodextrin

由表7可知，根據感官評分，當淀粉和麥芽糊精添加比例按1∶1（質量比）的比例進行添加時，口感及感官評分較高，因此可以確定淀粉和麥芽糊精以1∶1（質量比）的添加量進行添加。

2.2.1.6 最終配方確定

根據感官評價試驗，按照添加物的作用，選擇最佳口感及組織狀態的添加比例，最終確定配方如表8所示。

表8 超高壓協同酶解蛹蟲草提取物口含片配方Table 8 Formulation of UHP treament combined with cellulase extractive buccal table

2.2.2 口含片的質量檢測

2.2.2.1 片重差異、硬度、含化時間試驗結果

按《中國藥典》2005年版二部附錄中，隨機抽取藥片10片，精密稱取其總重量，如下表所示。按藥典規定0.3 g或0.3 g以上者，片重差異限度為±5%，超出片重差異的片劑一般要求≤2，由于含片單片重量較小，單片劑間差距小于±5%，符合要求。同時，按《中國藥典》2005版一部附錄中規定，硬度在3 kg～5 kg之間比較合適，共測10片，硬度在4左右，符合要求[23]。含化時間在12分鐘左右，超過要求中的水分含量。片重差異、片劑硬度及含化時間的檢測結果見表9。

表9 片重差異、片劑硬度及含化時間的檢測結果Table 9 Test results of tablet weight differences，hardness and solution time

2.2.2.2 蛹蟲草口含片衛生學檢驗結果

蛹蟲草口含片質量指標檢測結果見表10。

表10 蛹蟲草口含片質量指標檢測結果Table 10 Quality index results of Cordyceps malitaris buccal table

續表10 蛹蟲草口含片質量指標檢測結果Continue table 10 Quality index results of Cordyceps malitaris buccal table

2.3 蛹蟲草口含片增強免疫力功能實驗結果

2.3.1 臟器/體重比值測定結果

蟲草口含片對小鼠免疫器官指數的影響見表11。

表11 蟲草口含片對小鼠免疫器官指數的影響Table 11 Effects of Cordyceps malitaris buccal tables on immune organ index in mice

實驗結果顯示，蛹蟲草提取物口含片在高劑量組中可以極顯著增加小鼠的免疫器官指數，中劑量組也有顯著的提高，但低劑量組中變化不大，可以認為超高壓協同酶解蛹蟲草提取物口含片具有提高機體的體液免疫與細胞免疫的作用。

2.3.2 小鼠碳粒廓清實驗

小鼠碳廓清實驗顯示，口含片含量高、中、低劑量組吞噬指數較空白對照組均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05），但中劑量為較顯著，說明中劑量是對小鼠巨噬細胞系統較有利的劑量，如表12。

表12 蛹蟲草提取物口含片對小鼠碳粒廓清能力的影響Table 12 Effects of Cordyceps malitaris buccal tables on Macrophage Function

巨噬細胞廓清指數可以反映其吞噬功能的強弱[24]，巨噬細胞有吞噬、處理和呈遞抗原，激活淋巴細胞和分泌多種可溶性因子從而加強淋巴細胞活性的功能，參與免疫反應的傳入支路；同時它也是免疫效應細胞，能夠殺死細菌和腫瘤細胞，引起組織損傷，而參與免疫反應的傳出。在免疫應答反應中，免疫細胞通過直接接觸和它們分泌的可溶性因子發揮免疫調節和免疫效應作用[25]。

故試驗中喂食蛹蟲草提取物口含片對小鼠碳廓清的實驗結果顯示，其可以明顯增強小鼠的巨噬細胞吞噬能力，從而增強小鼠的非特異性免疫功能。

2.3.3 小鼠脾淋巴細胞增殖實驗

蛹蟲草提取物口含片對小鼠脾細胞增殖能力的影響見表13。

表13 蛹蟲草提取物口含片對小鼠脾細胞增殖能力的影響Table 13 Effects of Cordyceps malitaris buccal tables on spleen lymphocyte proliferation in mice

MTT實驗結果顯示，如表13，低劑量組與空白組比較無顯著性差異（P＞0.05），中計量組與空白組比較具有顯著性差異（P＜0.05），而高劑量組與空白組比較有較顯著性差異（P＜0.01）說明蛹蟲草提取物口含片能夠刺激小鼠的T淋巴細胞增殖，增強機體的細胞免疫能力；LPS刺激指數：喂食蟲草口含片低劑量組與空白組比較無顯著性差異（P＞0.05），中、高劑量組與空白組比較均具有顯著性差異（P＜0.05），說明蟲草口含片能夠刺激小鼠的B淋巴細胞增殖，增強機體的體液免疫能力。

3 結論

以超高壓協同酶解所得到的蛹蟲草提取物為原料，以感官評定為主要指標，確定了蛹蟲草口含片的工藝及配方。配方為蛹蟲草提取物10%，白砂糖15%，檸檬酸6%，淀粉30%，麥芽糊精30%，β一環糊精8%，硬脂酸鎂1%。同時考察所生產出的片劑的水分、灰分、硬度、片重差異等質量指標，均符合藥典對口含片的要求。

將口含片按照低中高的劑量喂食小鼠40 d，結果顯示喂食高劑量組的小鼠體重有較小的減少，但其胸腺及脾臟指數有顯著增加，而中劑量組小鼠在碳廓清及脾淋巴細胞增殖試驗中，巨噬細胞吞噬指數出現顯著提高。與空白中對比，喂食蛹蟲草提取物口含片可以提高小鼠巨噬細胞吞噬指數、T淋巴細胞轉化率和B淋巴細胞轉化率，說明蛹蟲草提取物口含片具有一定的增強免疫的作用。

所研制的蛹蟲草口含片喂食小鼠后，高劑量組的小鼠體重明顯下降，對蛹蟲草提取物是否具有減肥等其他功效可以進一步研究。以蛹蟲草提取物為主題的研究很廣，既有抗腫瘤、抗病毒、增強免疫方面的研究，也有與礦質元素結合成螯合物，促進人體的代謝吸收的研究，這些研究都涉及到人的生理代謝機制，對此，以后的研究要結合人體的代謝活動進行展開。

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