紅曲固態發酵過程中糖類物質的動態變化分析

嚴敏嘉，李小芳，趙甜甜，仲粒，吳純潔，何祖新，羅佳，*

（1.成都中醫藥大學藥學院，四川成都611137；2.四川得恩德藥業有限公司，四川綿陽612000）

紅曲由紅曲霉屬真菌接種于大米發酵而成[1]。明代《本草綱目》記載[2]：“紅曲，性溫、味甘，消食活血，健脾燥胃”。目前，關于紅曲的糖類成分研究多停留在液態發酵上[3]，大多學者對紅曲液態發酵中的多糖進行提取，純化和含量測定，再對多糖的抗氧化活性進行研究[4]，關于固態發酵紅曲中糖類物質的提取及含量測定的相關報道罕見。所以本研究對固態發酵紅曲糖類成分如總糖、還原糖、多糖和淀粉含量建立提取和檢測方法，并分析發酵過程中糖類物質的動態變化，以期為工廠的紅曲發酵糖類物質炮制機理及藥效物質基礎提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不 同 發 酵 天 數（1、3、6、9、12、15、22、30、45、60、75、90 d，一共12組）固態發酵紅曲樣品：四川得恩德公司。

D（+）-無水葡萄糖：中國科學院成都生物研究所，批號：MUST-15041507；α-淀粉酶（50 U/mg）：sigma 公司；3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、鹽酸、酒石酸鈉鉀、無水亞硫酸鈉，苯酚、蒽酮、濃硫酸、乙醇、石油醚、正丁醇、三氯甲烷：成都市科化工試劑廠，均為分析純。

酚酞指示劑[5]：取酚酞1 g，加乙醇100 mL超聲溶解，即得。

甲基紅指示劑[5]：取甲基紅0.1 g，加0.05 mol/L氫氧化鈉溶液7.4 mL使溶解，再加水稀釋至200 mL即得。

DNS 試劑[6]：稱取 3，5—二硝基水楊酸（2.5±0.1）g，置于約150 mL水中，逐漸加入0.1 mg/mL氫氧化鈉25 mL，在50℃水浴中（磁力）攪拌溶解，再依次加入酒石酸鉀鈉50 g、苯酚（重蒸）0.5 g和無水亞硫酸鈉1.25 g，待全部溶解澄清后，冷卻至室溫，用水定容至250 mL，過濾。貯存于棕色試劑瓶中，于暗處放置一周后使用。

1.2 儀器與設備

BP211D AG型電子天平：德國Satorius公司；DFD-700電熱恒溫水浴鍋：北京國華醫療器械廠；UPT-I-10T型超純水器：成都超純科技有限公司；SHZ-O（III）循環水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；RE-2000B旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；UV-6000型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液的制備

紅曲總糖：精密稱定紅曲粉末1.00 g至100 mL圓底燒瓶，加入6 mol/L HCL溶液10 mL、蒸餾水15 mL，回流提取0.5 h，用碘化鉀-碘溶液檢查淀粉是否水解完全，水解完全后離心得提取液，提取液以酚酞做指示劑，利用10%的NaOH溶液中和，溶液變紅即為終點，定容至100 mL容量瓶，再取提取液1 mL稀釋定容至10 mL，得總糖供試品溶液。

紅曲還原糖：精密稱定紅曲粉末2.00 g至100 mL圓底燒瓶，加入15倍蒸餾水，90℃提取2 h，離心取上清液，濃縮至5 mL，定容至10 mL容量瓶，即得還原糖供試品溶液。

紅曲多糖供試溶液：按課題組前期發表文獻[7]進行制備。

紅曲淀粉：精密稱定紅曲粉末1.00 g，10 mL石油醚沖洗進行脫脂，濾渣90℃干燥12 h，將干燥的粉末利用80%的乙醇10 mL，70℃水浴保溫進行脫糖處理，棄濾液，重復2次，收集濾渣；濾渣用25 mL水沸水浴15 min，使淀粉糊化，放冷至60℃，加淀粉酶60℃水浴保溫水解1 h，碘液檢測淀粉是否水解完全，若是不顯藍色則水解完全，隨后煮沸將淀粉酶滅活。冷卻后離心過濾，濾液用水定容至100 mL容量瓶，取25 mL濾液至圓底燒瓶，加6 mol/L鹽酸2.5 mL水浴回流1 h，回流液以甲基紅做指示劑，利用20%NaOH溶液滴定中和，指示劑變黃為反應終點，定容至50 mL容量瓶，得淀粉水解供試品溶液。

1.3.2 總糖和還原糖的含量測定

1.3.2.1 標準曲線的制備

葡萄糖對照品溶液的制備：精密稱取干燥無水葡萄糖對照品100 mg，以水定容至100 mL容量瓶，搖勻，即得1.0 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。

標準曲線的繪制：精密量取葡萄糖對照品溶液0.0、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置比色管，分別加水補至2.0 mL，再加入DNS溶液1.5 mL，混勻后沸水浴反應5 min后，冷卻，以水定容至10 mL。以第一份為空白對照，紫外-可見分光光度法在540 nm處測定吸光度[8]。以葡萄糖的含量（mg）為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，得到回歸方程：y=1.128 5x-0.122 3，R2=0.997 3，葡萄糖含量線性范圍：0.3 mg～1.0 mg。標準曲線見圖1。

1.3.2.2 DNS法顯色測定淀粉水解液、總糖、還原糖含量

精密量取紅曲淀粉水解液、總糖，還原糖供試品溶液1 mL至10 mL比色管中，補蒸餾水1 mL，加入DNS溶液1.5 mL，混勻，煮沸5 min，流水冷卻后用蒸餾水定容至10 mL。以水為空白同法顯色對照，在540 nm波長下做紫外檢測。

圖1 DNS法葡萄糖標準曲線圖Fig.1 Standard curve of glucose determination by DNS method

1.3.3 多糖含量測定方法

固態發酵紅曲中多糖的提取及含量測定按課題組前期發表文獻[7]。

1.3.4 總淀粉含量測定方法

由于本實驗利用的是國標法進行淀粉的含量測定，所以淀粉的水解液含量測定按照還原糖的測定方法來，同時量取50 mL水及與樣品處理時相同量的淀粉酶溶液，按同一方法做試劑空白試驗。最后在進行折算。

式中：X為樣品中淀粉的含量，%；A1為測定用樣品中還原糖的含量，mg；A2為試劑空白中還原糖的含量，mg；0.9為還原糖（以葡萄糖計）換算成淀粉的換算系數；m1為稱取樣品質量，g；V1為水解用樣品溶液體積，mL；V2為樣品定容總體積，mL；V3為測定用樣品處理液的體積，mL。

取不同時間點的固態發酵紅曲粉末，每一時間點取3份做平行試驗，照“1.3.1”項下進行紅曲總糖、還原糖提取，照“1.3.2”項進行總糖和還原糖含量測定，多糖提取及含量測定方法依據已發表文獻[7]。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 重復性試驗

取同一批紅曲粉末6份，樣品按照“1.3.1”項下供試品制備的方法同時制備6份總糖和還原糖供試品溶液照1.3.2.2項顯色后分別測定其吸光度A，結果RSD值分別為1.80%，2.11%。本方法重復性良好。

2.1.2 精密度試驗

分別取一份總糖和還原糖供試品溶液，照“1.3.2.2”項顯色后，連續測定其吸光度值6次。結果RSD值為1.39%和1.53%。證明儀器精密度良好。

2.1.3 穩定性試驗

分別取一份總糖和還原糖供試品溶液，照“1.3.2.2”項顯色后，每隔10 min測定其吸光度。結果在1 h內RSD值為1.16%和1.67%。表明供試品液顯色后在1 h內吸光度值基本穩定，而后呈下降趨勢。

2.1.4 加樣回收率試驗

取同一時間批次樣品6份，依1.3.1項制備總糖和還原糖供試品溶液，測定供試品溶液糖含量。取已知含量的供試品溶液再加入相當含量的葡萄糖標準液，照1.3.2.2項下顯色，得到測試液多糖含量，并計算回收率，結果見表1、2。兩者回收率分別為2.25%和2.23%，符合標準。

表1 固態發酵紅曲總糖回收率測定結果Table 1 Sample recovery determination results of the total sugar of monascus

表2 固態發酵紅曲還原糖回收率測定結果Table 2 Sample recovery determination results of reducing sugar of monascus

2.2 紅曲總糖含量動態變化

紅曲總糖含量動態變化見圖2。

圖2 固態發酵紅曲總糖含量變化Fig.2 The change of total sugar content in the solid fermentation of monascus

總糖的含量在第一天時高達76.77%，發酵初期平穩，12 d以后隨著發酵的進行呈下降趨勢，到達發酵第45 d，總糖含量維持在45%左右。

2.3 紅曲還原糖含量動態變化

紅曲還原糖含量動態變化見圖3。

圖3 固態發酵紅曲還原糖含量變化Fig.3 The change of reducing sugar content in the solid fermentation of monascus

還原糖含量在發酵初期僅有0.24%，隨后呈線性增長趨勢，發酵9 d時最高達1.47%，30 d以后趨于穩定，保持在1.2%左右。

2.4 紅曲多糖的含量動態變化

紅曲多糖的含量動態變化見圖4。

圖4 固態發酵紅曲多糖含量變化Fig.4 The change of Polysaccharidecontent in the solid fermentation of monascus

紅曲發酵初期多糖含量僅為0.95%，且發酵初期保持在1.3%左右。12 d以后含量持續增長，在30 d時達到最高6.14%，75 d以內基本穩定在5.5%左右，隨后呈下降趨勢。

2.5 紅曲淀粉的含量動態變化

紅曲淀粉的含量動態變化見圖5。

紅曲中淀粉含量初期高達60.78%，隨著發酵的進行呈下降趨勢，且初期下降快，后期下降慢，最后在發酵75 d停留在19.78%。

3 討論

本研究建立了固態發酵紅曲中總糖，還原糖和淀粉的含量測定方法，重復性、穩定性、精密度、加樣回收率等指標結果較好。可以用于固態發酵紅曲總糖，還原糖和淀粉的含量測定。

圖5 固態發酵紅曲淀粉含量變化Fig.5 The change of starch in the solid fermentation of monascus

試驗發現，紅曲發酵初期總糖的含量較高，這與大米含大量淀粉有關[9]。隨著發酵的進行，紅曲霉菌產生的淀粉酶、糖化酶等代謝物來水解淀粉以獲得碳源[10]，使淀粉和總糖含量在發酵過程中持續下降，發酵天數增加到75 d后含量基本保持不變，可能與紅曲霉菌處于生長平緩期或者代謝凋亡有關。

紅曲還原糖含量在發酵初期很低，1 d～9 d之內含量呈直線上升趨勢，與紅曲霉菌產生大量酶系代謝還原糖使其含量急劇增加有關[11]。但在9d以后趨于平穩，可能之后紅曲霉菌就不再代謝還原糖。

紅曲多糖在發酵初期增長緩慢，可能是紅曲霉菌代謝初期產少量多糖，12 d以后呈快速上升趨勢，說明霉菌在生長旺盛期可產生大量多糖。30 d時含量達到最高6.14%，發酵后期30 d～75 d保持平穩而后下降，可能是后期紅曲霉菌分解利用了其所產生的紅曲多糖所致[1]。

固態發酵紅曲相比于液體發酵紅曲具有產量高，處理簡單，污染小等優勢[11]，目前國內生產紅曲多為固態發酵，紅曲中糖類物質：淀粉，多糖，總糖，還原糖之前存在著密切的聯系，了解他們之間的物質變化規律，有助于對紅曲發酵質量進行控制。本課題整體考察了紅曲發酵期間糖類成分的含量變化，有助于從整體觀察紅曲發酵情況，以期為紅曲發酵炮制機理和藥效物質基礎提供研究數據。

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