響應(yīng)面法優(yōu)化小球藻多糖提取工藝研究

史瑞琴，李大偉，梁靜靜，王頡，馬艷莉

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

小球藻（chlorella）屬于綠藻門(mén)小球藻屬的單細(xì)胞綠藻，具有光合能力強(qiáng)、分布范圍寬、繁殖快以及應(yīng)用價(jià)值高等特點(diǎn)[1-2]。我國(guó)目前常見(jiàn)的普通小球藻細(xì)胞內(nèi)含有可觀碳水化合物、蛋白質(zhì)以及多種維生素，是一種天然的營(yíng)養(yǎng)均衡的食物來(lái)源，而小球藻多糖具有很強(qiáng)的生物活性，如：調(diào)免疫、降血脂、降血糖等，可用于臨床醫(yī)學(xué)、保健食品研發(fā)以及化妝品研制等[3]。

植物多糖常與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等結(jié)合形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖混合物，使多糖的高效提取造成一定困難[4-5]，而且單一使用酸、堿提法，超聲波法，微波法等都會(huì)損失一定量的多糖，所以研究?jī)煞N或多種提取方法的有效結(jié)合對(duì)植物多糖的提取具有重大意義。早期，多糖的提取采用提取效率極低的水提醇沉法[6]，而近年來(lái)隨著酶技術(shù)、超聲波技術(shù)以及微波技術(shù)[7-8]的不斷深入研究，使得這些方法在實(shí)踐中成功應(yīng)用。酶技術(shù)與超聲波技術(shù)的有效結(jié)合可加速原料中多糖溶入溶劑，從而進(jìn)一步使多糖的提取率增加[9]。因此，使用超聲波結(jié)合復(fù)合酶提取小球藻多糖、提高小球藻多糖的提取率對(duì)開(kāi)發(fā)小球藻資源具有重大意義。本試驗(yàn)采用單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化小球藻多糖提取工藝，為研發(fā)小球藻多糖保健品確立了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

小球藻粉：西安百川生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力≧60萬(wàn)單位/克）和纖維素酶（酶活力≧3千單位/克）：北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉（NaOH）、苯酚（C6H5OH）：上海市沃凱生物技術(shù)有限公司；95%乙醇（C2H5OH）：石家莊新宇三陽(yáng)有限公司；濃硫酸（H2SO4）：河南開(kāi)化化工產(chǎn)品經(jīng)銷有限公司；葡萄糖（C6H12O6）：山東天力化學(xué)試劑有限公司。

AR423CN電子天平、STARTER 2100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：奧豪斯（上海）儀器有限公司；H.SWX-600BS電熱恒溫水浴箱：常州朗博儀器制造有限公司；SK5200H超聲波清洗器：廣州科導(dǎo)儀器設(shè)備有限公司；Neofuge15R高速冷凍離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器公司；DHG-9143B5-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)：上海新苗醫(yī)療制造有限公司；752型紫外分光光度計(jì)：上海青華科技儀器有限公司；DL-1萬(wàn)用電爐：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 工藝流程

稱取小球藻粉1 g→加適量蒸餾水→超聲30 min→調(diào)pH→加酶→酶解30 min→滅酶→熱水浸提（70℃，4 h）→離心（4 500 r/min，0℃，15 min）→過(guò)濾取上清液→添加3倍體積95%乙醇→4℃靜置過(guò)夜→離心（4 500 r/min，0℃，15 min）→烘干→粗多糖

1.3 小球藻多糖含量測(cè)定

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（0.1 mg/mL）置于25 mL試管中，加蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL。編號(hào)0-6號(hào)，分別添加1.0 mL 6%苯酚溶液與5.0 mL濃硫酸，在自然條件下反應(yīng)5 min并經(jīng)過(guò)沸水浴10 min后冷卻到室溫。將0號(hào)作為對(duì)照，在490 nm處測(cè)定其的吸光度。分別以葡萄糖濃度、吸光度值為橫、縱坐標(biāo)，制作葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=13.142 86X-0.002，R2=0.999 6。

1.3.2 樣品測(cè)定與分析

對(duì)干燥后的小球藻多糖進(jìn)行溶解并稀釋至合適濃度之后，用苯酚硫酸法[10]測(cè)定小球藻多糖含量，多糖提取率為[11]：

多糖含量/%=（測(cè)量濃度×稀釋倍數(shù)×反應(yīng)液體積/粗多糖的質(zhì)量）×100

多糖提取率/%=（粗多糖的質(zhì)量/原料質(zhì)量）×100

1.4 單因素試驗(yàn)

為了探究復(fù)合酶對(duì)小球藻多糖提取率的影響，首先應(yīng)確定復(fù)合酶的作用效果是否比單一酶的效果好，為此設(shè)定反應(yīng)條件：液料比 25∶1（mL/g），pH 值 5，酶解溫度50℃。然后分別選擇不同添加量的纖維素酶、木瓜蛋白酶以及2種酶的復(fù)合酶，對(duì)小球藻藻液持續(xù)酶解30 min，對(duì)溶液處理后，測(cè)定小球藻多糖的提取率。

選用優(yōu)化后的酶種類及添加量，控制其他反應(yīng)條件，如：pH 值5、50℃酶解，測(cè)定不同液料比 10∶1、15∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）時(shí)小球藻多糖的提取率；依據(jù)其結(jié)果選擇最優(yōu)組合，控制酶解溫度50℃，分別測(cè)定 pH3、4、5、6、7 時(shí)小球藻多糖的提取率；擇其最優(yōu)組合，測(cè)定酶解溫度為 30、40、50、60、70 ℃時(shí)小球藻多糖的提取率。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以液料比（A），復(fù)合酶添加量（B），pH 值（C），酶解溫度（D），小球藻多糖提取率為自變量和唯一響應(yīng)值，按照Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)規(guī)律，采用四因素三水平的響應(yīng)面法操作試驗(yàn)，并優(yōu)化小球藻多糖的提取條件。分析因素及水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平取值和編碼表Table 1 Factor level values and coding tables

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗(yàn)主要通過(guò)Origin Pro 7.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，并用Design-Expert 8.05軟件處理分析試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)F值考察二次回歸模型及因素的顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果分析

2.1 復(fù)合酶法提取小球藻多糖的單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶種類和添加量對(duì)小球藻多糖提取率的影響

酶種類和添加量對(duì)小球藻多糖提取率的影響見(jiàn)表2。

表2 酶種類和添加量對(duì)小球藻多糖提取率的影響Table 2 Effects of enzyme types and amount on extraction rate of polysaccharide from chlorella

續(xù)表2 酶種類和添加量對(duì)小球藻多糖提取率的影響Continue table 2 Effects of enzyme types and amount on extraction rate of polysaccharide from chlorella

由表2可見(jiàn)，使用酶的種類不同，小球藻多糖的提取率也不同，但小球藻多糖得率的變化趨勢(shì)基本相同，都是當(dāng)酶的添加量增加時(shí)而隨之增大，到達(dá)一定程度后稍有降低。單獨(dú)使用一種酶或使用復(fù)合酶的添加量為1.5%時(shí)，小球藻多糖的提取率均達(dá)到最高。其中使用1.5%的復(fù)合酶時(shí)，小球藻多糖的提取率最大（5.25%）。因此，本試驗(yàn)擬定使用復(fù)合酶進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1.2 復(fù)合酶添加量對(duì)小球藻多糖提取率的影響

復(fù)合酶添加量對(duì)小球藻多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 復(fù)合酶添加量對(duì)小球藻多糖提取率的影響Fig.1 Effect of compound enzyme amount on extraction rate of polysaccharide from chlorella

由圖1可得，多糖提取率在酶添加量增大時(shí)呈現(xiàn)出上升趨向，而且在酶的添加量為0.5%到1.5%時(shí)增長(zhǎng)較快，到達(dá)1.5%后緩慢降低。出現(xiàn)這種變化趨勢(shì)的原因可能是添加適量酶時(shí)可促進(jìn)多糖的溶解，但是當(dāng)添加過(guò)量酶時(shí)底物反應(yīng)完全后，酶會(huì)進(jìn)一步分解糖苷鍵，導(dǎo)致小球藻多糖提取率降低。因此選取1.5%為適宜的復(fù)合酶添加量。

2.1.3 液料比對(duì)小球藻多糖提取率的影響

液料比對(duì)小球藻多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 液料比對(duì)小球藻多糖提取率的影響Fig.2 Effect of the ratio of solvent to material on extraction rate of polysaccharide from chlorella

由圖 2可得，當(dāng)液料比例為 20∶1（mL/g），小球藻多糖的得率達(dá)到最大，之后隨著液料比的增大小球藻多糖的得率趨于穩(wěn)定。表明當(dāng)液料比為20∶1（mL/g）時(shí)多糖基本已溶出充分。因此選取20∶1（mL/g）的液料比。

2.1.4 pH值對(duì)小球藻多糖提取率的影響

酶解pH值對(duì)小球藻多糖提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶解pH值對(duì)小球藻多糖提取率的影響Fig.3 Effect of pH value on extraction rate of polysaccharide from chlorella

由圖3可得，當(dāng)pH值過(guò)小時(shí)會(huì)對(duì)小球藻多糖的得率造成較大的影響，當(dāng)pH值為5.0時(shí)，小球藻多糖的得率最大，隨后pH值持續(xù)增大時(shí)，多糖的得率反而降低。這可能是由于兩種酶的最適pH值均偏酸性，當(dāng)溶液pH值為中性時(shí)，酶的活性降低影響小球藻多糖的提取率。綜上所述，試驗(yàn)比較適宜的pH值為5.0。

2.1.5 酶解溫度對(duì)小球藻多糖提取率的影響

酶解溫度對(duì)小球藻多糖提取率的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可得，當(dāng)進(jìn)行40℃酶解時(shí)，小球藻多糖的提取率達(dá)到頂峰。當(dāng)酶解溫度小于40℃時(shí)，小球藻多糖提取率隨酶解溫度的提高而隨之增大，這可能是因?yàn)槊附鉁囟仍龃髸r(shí)，反應(yīng)物與底物分子之間的碰撞越強(qiáng)烈，反應(yīng)物與酶之間互相接觸的幾率大大提高。但當(dāng)酶解溫度達(dá)到40℃后，在高溫條件下，酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致酶活性降低，從而使小球藻多糖的提取率降低。綜上所述，40℃為比較適宜的酶解溫度。

圖4 酶解溫度對(duì)小球藻多糖提取率的影響Fig.4 Effect of enzymatic temperature on extraction rate of polysaccharide from chlorella

2.2 小球藻多糖提取的響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因子試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇液料比（A）、復(fù)合酶添加量（B）、pH（C）、酶解溫度（D）4個(gè)變量，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶法提取小球藻多糖的條件，其結(jié)果如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken test design and results

續(xù)表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 3 Box-Behnken test design and results

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，可得小球藻多糖提取率的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=6.56-0.075A-0.060B+0.41C-0.13D-0.11AB+0.49AC-0.12AD-0.14BC-0.010BD-0.073CD-0.32A2-0.47B2-1.08C2-0.61D2

式中：Y為小球藻多糖提取率。對(duì)該模型的方差及顯著性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 二次回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance the regression model

由表4可以得出，二次多項(xiàng)的回歸項(xiàng)P值為0.002 6，差異顯著（P＜0.05），失擬項(xiàng) P 值為 0.234 1，不顯著（P＞0.05）。所以該模型的擬合度較高，可以用于對(duì)二次回歸方程的相應(yīng)值進(jìn)一步預(yù)測(cè)；此外，該模型的決定系數(shù)R2=0.830 7，表明預(yù)測(cè)值與真實(shí)值有較高的相關(guān)性；而變異系數(shù)CV=0.134 5，說(shuō)明試驗(yàn)可操作性較好。綜上述分析可知，此模型可以用來(lái)分析和預(yù)測(cè)小球藻多糖提取率的真實(shí)情況。每種因子對(duì)小球藻多糖得率的影響程度為：pH＞酶解溫度＞液料比＞復(fù)合酶添加量。

2.2.2 響應(yīng)面分析

按照回歸模型繪制響應(yīng)曲面三維圖，從而清晰地呈現(xiàn)出料液比、復(fù)合酶添加量、pH、酶解溫度對(duì)小球藻多糖得率的影響，其結(jié)果如圖5～圖10所示。

圖5 復(fù)合酶添加量與液料比對(duì)提取率的響應(yīng)面圖Fig.5 Effects of compound enzyme amount and ratio of solvent to material on extraction ratio

圖7 酶解溫度與液料比對(duì)提取率的響應(yīng)面圖Fig.7 Effects of enzymolysis temperature and ratio of solvent to material on extraction ratio

圖8 pH與復(fù)合酶添加量對(duì)提取率的響應(yīng)面圖Fig.8 Effects of pH and compound enzyme amount on extraction ratio

圖9 酶解溫度與復(fù)合酶添加量對(duì)提取率的響應(yīng)面圖Fig.9 Effects of enzymolysis temperature and compound enzyme amount on extraction ratio

圖10 酶解溫度與pH對(duì)提取率的響應(yīng)面圖Fig.10 Effects of enzymolysis temperature and pH on extraction ratio

響應(yīng)曲面圖可以表示試驗(yàn)因素的每個(gè)水平之間與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系，同時(shí)可直觀的獲取試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)工藝參數(shù)。由圖5～圖10可知，料液比與pH的交互作用顯著，pH與復(fù)合酶添加量、液料比與酶解溫度、料液比與復(fù)合酶添加量、pH與酶解溫度之間的交互作用依次降低，復(fù)合酶添加量與酶解溫度之間的交互作用最小。通過(guò)對(duì)響應(yīng)面圖的陡峭程度分析可知，pH對(duì)小球藻多糖得率的影響最大，酶解溫度與液料比對(duì)其影響相對(duì)較小，而復(fù)合酶添加量的影響最低，這與前面方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 最佳提取工藝條件的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化，軟件Design-Expert.V8.0分析得復(fù)合酶法提取小球藻粗多糖的最佳的條件為液料比20.48∶1、復(fù)合酶添加量1.45%、pH值5.22、酶解溫度38.76℃，此條件下小球藻多糖提取率的預(yù)測(cè)值為6.617%。為使得現(xiàn)實(shí)中更加便捷地進(jìn)行試驗(yàn)，將上述預(yù)測(cè)的最佳條件修改為液料比20∶1（mL/g）、復(fù)合酶添加量1.45%、pH值5以及酶解溫度39℃。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠窨煽浚瑢?duì)上述修改后的提取條件做3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，小球藻多糖提取率平均為6.56%，實(shí)際值和預(yù)測(cè)值的相差為0.52%。證明所建立的模型對(duì)預(yù)測(cè)小球藻多糖得率是準(zhǔn)確可行的。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同液料比的小球藻藻粉溶液進(jìn)行超聲波處理后，使用復(fù)合酶法對(duì)小球藻多糖進(jìn)行浸提，選取料液比、復(fù)合酶添加量、pH值和酶解溫度執(zhí)行單因素試驗(yàn)，并確定各水平后使用響應(yīng)面優(yōu)化提取條件，即小球藻多糖的最佳提取條件為：液料比20∶1（mL/g）、復(fù)合酶添加量1.45%、pH值5、酶解溫度為39℃。本試驗(yàn)為小球藻多糖的提取方法及提取條件提供了一定的理論參考。

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