免疫刺激寡肽Neogen的合成

李 晨，陳 科，范永剛，郭 添，楊小琳，趙金禮

（陜西慧康生物科技有限責任公司，陜西 西安 710054）

隨著科學技術的發展和不斷創新，日臻成熟的生物技術和多肽合成技術使得越來越多的多肽藥物被開發并應用于臨床。寡肽Neogen，又被稱為IEW，其氨基酸序列為Ile-Glu-Trp，是一種具有免疫刺激劑適應癥的生物活性肽，其在經過細胞抑制劑治療、化療、術后感染后免疫系統和造血功能的恢復方面有顯著的治療效果。

寡肽是指氨基酸數目為2～10個的生物活性肽，其特點是可以像小分子一樣穿越細胞膜，通過生理屏障，吸收快速且不消耗人體能量。所以，它被用作藥物載體輸送到人體的細胞組織中去，并可作為多肽藥物應用于醫藥和化妝品等領域，具有生物活性高、特異性強、副作用小的優點。目前，處于研發階段的多肽藥物成百上千，開發領域也延伸到各種適應癥。

免疫刺激劑治療是最早開展的腫瘤生物治療。眾所周知，機體具有免疫功能，但由于癌過程的漸進性、腫瘤抗原隱匿性等特定的因素，機體的抗癌免疫力遠沒有抗微生物免疫那么迅捷、有效。免疫激發是免疫反應的初始環節，在抗癌免疫中也是最重要的環節之一。免疫刺激劑的作用就是激發機體的免疫反應，達到抗癌免疫同時其被加強的目的。

Neogen是一種潛在的血生成刺激因子，會對造血功能機制產生影響[1]。在腫瘤化療中，造血功能損害是一個嚴重的問題。大量的生物試驗研究表明，Neogen會影響小鼠造血功能的恢復，可降低細胞靜力學對造血的毒性作用，能有效促進小鼠血紅素的恢復[2]，對造血前體細胞的增殖有積極影響，同時，也能刺激恢復血栓的形成[3]。目前，相關研究正處于臨床二期。研究表明，通過對血管緊張素抑制酶抑制活性的評估，Neogen作為一種有力的抑制劑，在治療高血壓方面有較大的潛力[4]。

目前，國內、國際關于小分子多肽的生物活性的研究非常多，然而合成方案卻鳳毛麟角。本文簡要介紹了一種固相合成多肽的方案。以2-氯三苯甲基氯樹脂為載體，以Fmoc保護的氨基酸為原料，從C端到N端依次縮合，合成目標肽鏈，將其酸解脫去樹脂和各種保護基團，得到目標肽粗品，然后進行反向色譜純化和離子交換，得到最終純品肽。

1 實驗部分

1.1 主要的原料和試劑

實驗中用到的主要原料和試劑有：Fmoc-Ile-OH（吉爾生化上海有限公司）、Fmoc-Glu（OtBu）-OH（吉爾生化上海有限公司）、Fmoc-Trp-OH（吉爾生化上海有限公司）、DMF（分析純，西安浩業化工有限公司）、DIC（吉爾生化上海有限公司）、HOBt（吉爾生化上海有限公司）、DIEA（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）、DCM（分析純，西安浩業化工有限公司）、異丙醇（分析純，西安浩業化工有限公司）、哌啶（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）、甲醇（分析純，西安浩業化工有限公司）、2-CTC Resin（吉爾生化上海有限公司）。

1.2 主要儀器

實驗中用到的主要儀器有：超聲波清洗器（昆山市儀器有限公司KQ-500B）、循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司 SHB-Ⅲ）、電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司 SE6001F）、制備高效液相色譜儀（創新通恒LC3000）、分析高效液相色譜儀（日立全自動L2000系列）、C18分析色譜柱（大連物理化學研究所4.6 mm×250 mm）、弱陰離子交換柱（自填體積為150 mL，保賽生物科技公司填料，粒徑為45～165 μm的DEAE高流速瓊脂糖微球）、C18制備色譜柱（成都科譜生物有限公司，50 mm×450 mm）。

1.3 實驗方法

1．3．1 樹脂活化

將3.0 g的2-CTC-Resin樹脂（批號為G55S1131-1，交聯度為1%DVB，粒徑為100～200目，取代度為1.75 mmol/g）加入反應器中，加入30 mL的DCM，室溫攪拌浸泡10 min使其充分溶脹活化。

1．3．2 合成 Fmoc-Trp-2-CTC Resin 肽樹脂

在步驟1.3.1的樹脂中加入Fmoc-Trp-OH（2.46 g）、DIEA（4 mL）、DCM（30 mL），室溫攪拌反應2 h，第二次加入Fmoc-Trp-OH（2.23 g）、HOBt（1.42 g）、DIEA（1.6 mL）、DCM（20 mL），室溫攪拌反應1 h，用30 mL異丙醇和30 mL的DMF各洗滌2次，得到保護肽樹脂。

1．3．3 合成 H-Trp-2-CTC Resin 肽樹脂

在1.3.2的樹脂肽中加入100 mL質量分數為20%哌啶的DMF溶液，室溫攪拌反應30 min。抽濾去除溶液，再次加入100 mL質量分數為20%哌啶的DMF溶液，室溫攪拌反應10 min，除掉2-CTC Resin上的9-芴甲氧羰基基團，用100 mL的異丙醇和100 mL的DMF各洗滌2次，得到H-Trp-2-CTC Resin肽樹脂。

1．3．4 合成 H-Ile-Glu（OtBu）-Trp-2-CTC Resin 肽樹脂

按照步驟1.3.2和1.3.3，依次連接Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Ile-OH，得到H-Ile-Glu（OtBu）-Trp-2-CTC Resin肽樹脂，用30 mL異丙醇和30 mL的DMF各洗滌2次，甲醇洗滌3次，干燥后得5.1 g樹脂肽。

1．3．5 合成制備三肽 Neogen

配制肽樹脂切割液時，將三異丙基硅烷、三氟乙酸、苯甲硫醚和水按體積比為5∶4∶88∶3加入到燒杯內攪拌混合。切割肽樹脂時，在1.3.4的肽樹脂中加入50 mL切割液，室溫攪拌反應2 h，過濾，三氟乙酸洗滌樹脂2次，濾液在35℃濃縮至油狀物，然后傾倒到冷凍的40 mL無水乙醚中，大量淡黃色固體析出，過濾，冰乙醚洗滌濾餅，得目標肽粗品，經反相色譜法純化、濃縮、凍干得到三肽Neogen純品1.9 g，純度大于99.5%，收率74%.

圖1 Neogen最終產品HPLC分析圖譜

2 結果討論

圖1為Neogen最終產品HPLC分析圖譜，表1為峰結果。從圖1中可以看出，Neogen最終產品的純度大于99%，得到純品1.9 g，產率74%.

表1 峰結果

3 結論

本文介紹了一種固相法合成Neogen的方法，這種方法具有操作簡單快捷、副產物少、易于分離純化、可重復性高的特點。與液相合成方法相比，這種方法縮短了合成時間，節省了試劑用量，中間體無需柱層析和重結晶。這次研究也為日后大規模生產提供了成熟有效的合成方案。

［1］Semina，Deigin，Vinogradova，Yu.Postradiation recovery of hemopoiesis in mice affected by Neogen（IEW）［J］.Radiats.Biol.Radioekol，2002，42（1）：70-74.

［2］TN Semenets，OV Semina，YY Vinogradova，et al.Application of synthetic immunomodulating peptides for correction of hemopoiesis in mice after administration of the cytostatic agent cytosine arabinoside（Ara-C）［J］.Immunologiya，2000（6）：20-22.

［3］Ziablitski? VM，Semina OV，Semenets TN，et al.Immunogenic peptide neogen stimulates postradiation recovery thrombopoiesis［J］.Radiats Biol Radioecol，2003，43（1）：49-50.

［4］VK Jimsheena，LR Gowda.Arachin derived peptides as selective angiotensin I-converting enzyme（ACE）inhibitors：structure-activity relationship［J］.Peptides，2010，31（6）：1165-1176.

［5］王德心.固相有機合成（原理及應用指南）［M］.北京：化學工業出版社，2004：125.