斑馬魚幼魚生物鐘節律行為方法的建立

鄭彥文　蔡靖　仲兆民

【摘 要】所有生物體均受到生物鐘的調控而產生行為和生理的節律變化，運動行為節律是反應生物節律的最可靠標志。斑馬魚是研究行為學的良好模式動物。為了探討斑馬魚幼魚在持續黑暗或者持續光照條件下的行為節律方法，選擇發育至5 dpf （受精后天數）的幼魚，放置于諾達思行為分析儀中，分別采取持續弱光（DD，30 lux）、持續光照（LL，300 lux）以及正常光照黑暗（LD，14小時光：10小時暗）三個光照條件，檢測斑馬魚幼魚連續三天的運動行為變化。結果顯示斑馬魚幼魚在正常光暗條件下顯示出明顯的晝夜節律，即光照時運動多，黑暗時運動少。而在兩個持續條件下均表現出明顯的生物鐘節律，并且統計算出的周期均在24小時左右。但是持續光照條件（LL）下的平均運動距離要明顯高于持續弱光條件（DD）。因此，通過本實驗建立起可靠的斑馬魚幼魚行為節律分析方法，為今后以斑馬魚為模型研究不同光暗條件下生物鐘行為提供了良好的實驗基礎。

【關鍵詞】斑馬魚；生物節律；行為學

中圖分類號： R965 文獻標識碼： A 文章編號： 2095-2457（2018）30-0136-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.30.058

Establishment of the Circadian Behavioral Method in Zebrafish Larvae

ZHENG Yanwen， CAI Jing， ZHONG Zhaomin

（Soochow University， Suzhou Jiangsu 215123， China）

【Abstract】All organisms show daily rhythms in behaviour and physiology， and are regulated by the circadian clock. The activity behaviour have been shown to be a reliable marker for ciracdian rhythms. In recent times zebrafish have proven to be a good model system for behavioural studies. In the present study we examined the activity rhythms under different light conditions， such as light-dark cycle （LD） and constant darkness （DD） or light （LL）， in zebrafish. For this， 5 dpf （days after fertilization） larvae were placed into 48 well plate， continous videos were recorded， tracked and analyzed using Noldus behavioral apparatus under normal light-dark cycle （14 h light： 10 h dark）， constant dim light （30 lux） and constant bright light （300 lux）. We measured the changes in locomoter activity for three consecutive days. The results showed that the zebrafish showed synchronised daily rhythms in activity behaviour under light-dark cycle with a diurnal pattern， active during the day and rest during the night. Interestingly， in both LL and DD， the activity behaviour showed circadian pattern with period of ～24 hours. However， the activity was significantly higher under LL， compared to DD condition， which we reason as a direct effect of bright light on the behaviour. This sets a reliable method for analyzing the activity rhythms of zebrafish and established zebrafish as a good model to study circadian rhythms under different light conditions.

【Key words】Zebrafish； Circadian rhythm； Behavior

生物節律（生物鐘）是指生物體為了適應由于地球自轉引起的晝夜變化而形成的行為、代謝、免疫等多方面的以大約24小時為周期的節律變化過程[1]。生物節律的變化影響到包括人類在內的絕大多數生物的多種生理功能。2017年諾貝爾生理醫學獎的獲得者主要研究領域即是果蠅的生物鐘行為[2]。這也凸顯了生物鐘研究的重要性。

傳統的生物鐘研究模式動物主要是小鼠和果蠅，但近些年斑馬魚領域多種遺傳學手段出現使得斑馬魚也成為研究生物節律的優良模型[3]。斑馬魚為晝行性動物，因此同小鼠相比，與人類的晝夜節律行為更相近；并且作為脊椎動物模型，同果蠅相比與人類的親緣關系更近；生物節律的主要控制器在大腦，斑馬魚產卵量高、胚胎體外發育、易于顯微注射及胚胎透明的特點，研究者可以很好的利用遺傳學手段研究斑馬魚幼魚大腦的功能，并且可以進行快速、大規模的活體藥物篩選[3]。

行為節律是反應動物體生物節律的最明顯的特征，在人類、小鼠及果蠅等物種中，持續黑暗條件下的行為節律還能保持近24小時的周期，并持續數天[4]。但是利用斑馬魚研究行為節律的報道卻非常少。為了更好的利用斑馬魚作為研究行為節律的模型，本研究分析了斑馬魚幼魚在多個光暗條件下的行為表現，現報道如下。

1 實驗部分

1.1 動物

6-12月齡TUBABC品系野生型斑馬魚成魚，飼養于蘇州大學生物鐘研究中心。采用專業的飼養系統（上海海圣工貿有限公司）進行飼養，水溫維持在28.5±1℃，pH為7.2-7.6之間，魚房的光照周期為14小時光照/10小時黑暗，即14L：10D，每天早晚喂食豐年蝦，中午喂食干飼料。

1.2 斑馬魚胚胎及幼魚的獲得

第一天晚上將一對斑馬魚成魚放置于交配盒中，中間用擋板將雌雄分開。第二天魚房燈亮后將擋板抽掉，一小時后收集胚胎，胚胎放置于E3培養液中，并加入少量甲基纖維素。將未受精胚胎挑出后，剩余胚胎放置于魚房光暗條件（14L：10D，300 lux），28.5℃培養。待斑馬魚幼魚發育至5 dpf（受精后天數，days post fertilization）時放于行為儀中。

1.3 幼魚行為

實驗儀器為斑馬魚行為分析儀（Noldus Information Technology）。儀器內有紅外高速攝像頭，可捕捉每個孔的幼魚運動參數。將5dpf斑馬魚幼魚放置于48孔板中，每個孔放置一條幼魚。每個孔及孔與孔之間的間隙均加滿水，但液面需要保持水平，不要凸出來，保證實驗中水分蒸發較慢，并且每個孔里的幼魚不能游到其他孔中。每個孔加入200μl的草履蟲液體，去掉48孔板的蓋子，將孔板放入行為儀中。選擇儀器實時監測功能，分別采取持續弱光（DD，30lux）、持續正常光照（LL，300lux）以及正常光照黑暗（LD，14小時光：10小時暗）三個光照條件進行實驗。實驗時間為連續三天即5dpf-8dpf。

1.4 結果及統計分析

斑馬魚行為分析儀捕獲的數據先用系統自帶的分析軟件進行分析（Ethovision 10.0 software ，Noldus Information Technology），數據的獲取均使用10分鐘作為時間間隔。生成的數據表示為平均值±標準誤。再使用Matlab軟件采用非線性最小二乘最小化方法（nonlinear least-squares minimization method）分析其節律周期和振幅。

2 結果

2.1 三種光照條件下的行為及平均活動量比較

在持續弱光（DD）和持續光照（LL）條件下的幼魚行為均表現出明顯的節律性，即相對的白天活躍，相對的晚上運動較少（圖1A， B）。在連續三天的檢測時間內，兩個條件下的行為結果均有三個波峰及三個波谷，證明為近24小時的周期節律（圖1A， B）。而在正常光暗（LD）條件下，幼魚的活動與是否有光呈明顯相關性，有光時活動要顯著高于無光時的活動量（圖1C）。分別統計LD條件下的白天（L）及夜晚（D）行為，并且與DD及LL條件下的平均活動量比較，結果表明DD條件下的平均活動量最低，LD條件下的黑暗時間的活動量其次，然后是LL條件下的平均活動量，LD條件下的白天活動量最高（圖1D）。

2.2 持續弱光（DD）及持續光照（LL）條件下的周期及振幅比較

經過分析LL條件下周期為23.35±0.11小時，DD條件下的周期為23.58±0.10小時，均為近24小時的周期節律。LL條件下的相對振幅1.05±0.03，DD條件下為1.16±0.03。

圖1三種光暗條件下的行為變化及平均活動量比較。（A）持續弱光（30lux，DD）條件下的行為節律。（B）持續光照（300lux，LL）條件下的行為節律。（C）正常光暗（LD）條件下的行為變化。（D）三種條件下的平均活動量比較。數據表示為均值±標準誤。

3 結論

通過本實驗很好的建立起了斑馬魚幼魚的行為節律方法。無論是持續黑暗還是持續光照條件下，斑馬魚幼魚均表現出明顯的節律行為，并且周期均在24小時左右。另外利用正常光暗條件實驗可以檢測光照或黑暗時斑馬魚幼魚的活動量差異。本研究為今后以斑馬魚為模型研究生物鐘行為提供了良好的實驗基礎。

【參考文獻】

[1]安揚，徐瓔.哺乳動物晝夜節律機制研究進展[J].生命科學，2015，27（11）：1372-1379.

[2]Wang， H. Perfect timing： A Nobel Prize in Physiology or Medicine for Circadian Clocks[J].Science Bulletin， 2018， 63：398-401.

[3]仲兆民，張淑青，王晗.斑馬魚生物鐘分子遺傳學和基因組學研究進展[J].生命科學，2015，27（11）：1364-1371.

[4]梅龍，桑迪，張二荃.生物鐘研究方法綜述：追求長程、實時的記錄[J].中國生物化學與分子生物學報，2018，34（10）：1021-1029.