青海省馬鈴薯軟腐病病原菌的鑒定

王 信，程 亮，蔡曉劍，王亞藝，高旭升，李松齡

(1.青海大學 農林科學院 土壤肥料研究所，西寧 810016；2.青海大學 省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，西寧 810016；3.青海大學 農林科學院 植物保護研究所，西寧 810016)

馬鈴薯是青海省的主要糧食作物，是結構調整中重點發展的十大產業之一，而且成為青海省農民增收的主要產業。2013年青海省馬鈴薯種植面積達到9.56萬hm2，總產量達到2 150萬t[1]，僅次于小麥和油料，成為第三大作物，主要種植于互助、民和、樂都、湟中、大通、平安等東部各縣的山區。馬鈴薯軟腐病是青海馬鈴薯生產的主要病害之一，該病害初期僅在局部地區發生，隨著帶病種薯的頻繁調運，種植面積逐年擴大，危害越來越大。因此，防治馬鈴薯軟腐病是確保青海省馬鈴薯高產、穩產的重要環節，也是確保收獲的塊莖能夠安全儲藏的重要條件之一。果膠桿菌屬(Pectobacterium)病原菌是造成馬鈴薯軟腐病、莖枯萎和黑脛病以及其他寄主植物的致病菌，在作物生長、繁殖、運輸和儲藏期間都可造成危害，引起作物經濟損失。果膠桿菌屬系腸桿菌科的一員，和其他致病因子一樣，分泌大量的植物細胞壁降解酶，引起植物組織浸漬和水浸癥狀，感染植物組織后通常表現為軟腐[2-3]。果膠桿菌屬依據其寄主范圍、生理生化和分子特征，將其分為5個種，分別為軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種[Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum(Pcc) (syn.Erwiniacarotovorumsubsp.carotovorum)],黑腐果膠桿菌[P.atrosepticum(Pa) (syn.E.carotovorumsubsp.atrosepticum)],山葵果膠桿菌[P.wasabiae(Pw) (syn.E.carotovorumsubsp.wasabiae)],軟腐果膠桿菌甜菜亞種[P.betavasculorum(Pbv) (syn.E.carotovorumsubsp.betavasculorum)]和軟腐果膠桿菌巴西亞種[P.carotovorumsubsp.brasiliense(Pcb)][4]。果膠桿菌屬寄主范圍廣泛，從土壤、水體、寄主植物和節肢動物上都可以分離獲得此屬的菌株。其中Pa通常在溫帶寄主植物上存活[5]，而Pcb和Pw通常在熱帶和亞熱帶地區引起馬鈴薯軟腐病和黑脛病[6]。目前為止，果膠桿菌屬引起馬鈴薯軟腐病在中國部分地區已有報道，然而青海地區馬鈴薯軟腐病致病菌的致病性和分類鑒定鮮有報道。本研究從青海省的樂都縣、互助縣、湟中縣、大通縣和平安縣馬鈴薯生產田的馬鈴薯軟腐病的發病塊莖組織中分離病原菌，通過對病原菌的形態觀察、生理生化指標測定，分析馬鈴薯軟腐病病原菌的致病性、表型特征和16S rRNA基因序列的系統發育樹，明確青海省馬鈴薯細菌性軟腐病的病原菌種類及其生物學特征和致病力差異。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及培養基

馬鈴薯軟腐病標樣采集于青海省的樂都縣、互助縣、湟中縣、大通縣和平安縣的馬鈴薯生產田。

結晶紫果膠酸鹽選擇性培養基(CVP)：在500 mL沸騰的蒸餾水中按順序加入1 mL 0.75 g/L 結晶紫溶液，4.5 mL 1 mol/L NaOH溶液，3 mL 100 g/L CaCl2·2H2O溶液(新鮮溶液)，3.0 g瓊脂粉，1.0 g NaNO3，9.0 g聚果膠酸鈉，在聚果膠酸鈉加入時人工攪拌30 s，然后分別裝入三角瓶，121 ℃滅菌20 min，趁熱將培養基倒入無菌培養皿中，冷卻后制成平板。

Luria-Bertani培養基(LB)：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g，瓊脂粉15 g，用去離子水混合定容至1 000 mL，pH 7.0。然后分別裝入三角瓶，121 ℃滅菌20 min，趁熱將培養基倒入無菌培養皿，冷卻后制成平板。

1.2 病原菌分離

采用常規組織分離法分離病原菌。稱取0.1 g 病塊莖置于250 mL的三角瓶中，并加入100 mL 的蒸餾水，放入玻璃珠充分打散混合液，置于120 r/min 搖床中，培養30 min后，充分搖勻。用1 mL無菌的吸管吸取10-2mL-1菌懸液1 mL放入9 mL的無菌水管中，吹吸 3次混勻即為10-3mL-1稀釋液，依次從10-3mL-1連續稀釋至10-7mL-1，即得一系列10倍的稀釋液。每個梯度重復進行3次平行試驗，分別涂布到CVP培養基上，25～27 ℃黑暗培養48 h，將形態典型的菌落在CVP培養基反復劃線，進行純化培養，挑取單菌落進行編號和保存。

1.3 致病力測定

選擇健康馬鈴薯品種‘大西洋’的塊莖用于致病性分析。將5個待測菌株于液體LB培養基中培養24 h，用無菌的9 g/L溶液洗滌3次后，配置5×108cfu/mL的菌懸液。將無病的大小均勻的塊莖用自來水沖洗后放入5 g/L NaCl溶液中洗2次，每次20 min，然后用無菌去離子水沖洗1～2次，放入超凈臺中自然晾干，用無菌竹牙簽給每個塊莖打2～3個接種孔，深度約為20 mm，用9 g/L NaCl溶液配制成5×108cfu/mL的菌懸液，取10 μL加入接種孔中，每個菌株接種10個塊莖。用凡士林將塊莖上的接種孔封口保濕，將接種的塊莖置于溫度為22 ℃、相對濕度≥92%的溫室培養。同等條件下，設無菌9 g/L NaCl溶液為空白對照。接種后72 h時測量病斑的直徑并取其平均值作為病斑平均直徑。按以下分級標準記錄病斑：1～5 mm為弱致病力，5～10 mm為中等致病力，10 mm以上為強致病力。

1.4 菌株形態和生物化學特性分析

菌落形態、革蘭氏染色和鞭毛染色、檸檬酸鹽分解及37 ℃生長測定參照《植病研究方法》(第3版)[7]進行。病原菌對蔗糖、麥芽糖、山梨醇、阿拉伯醇、乳糖和α-甲基葡糖苷等的利用測定試驗參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第8版)[8]和《植病研究方法》(第3版)[7]進行。選用青海大學農林科學院土壤肥料研究所農業微生物實驗室(以后稱本實驗室)保存的軟腐病致病菌Pa(編號:Ba11)和Pcc(編號: ECC71)為對照菌株。

1.5 16S rRNA基因片段的擴增與序列分析

1.5.1 基因組DNA的提取 將保存于-80 ℃冰箱的菌株劃線，并于28 ℃培養箱中倒置培養過夜活化，挑取單菌落放入液體LB培養基中，置28 ℃培養16～18 h。病菌DNA的提取使用Ezup柱式SK8255試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]。取1 μL DNA溶液用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA于-20 ℃保存，備用。

1.5.2 16S rRNA片段的擴增 應用細菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCGGCTCAG-3′)；1942r(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進行擴增。每個PCR反應體系總體積均為25 μL，包括2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL(編號為KT201-02，Tiangen)，DNA模板(50 ng/L)1 μL，引物各1 μL，雙蒸水10.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，40個循環；72 ℃延伸10 min。回收大小約1.5 kb的PCR產物。將其連接到pGEMT-Easy載體(Promega corp.，美國)上，轉化到大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態細胞中。重組質粒經NotⅠ酶切和PCR鑒定后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5.3 16S rRNA系統發育樹構建 測序結果用軟件Chromas(ver.2.4.1)進行序列修正后，在NCBI數據庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blast檢索與目標序列同源性高的DNA序列，與本文所測菌株序列分別進行比對。利用軟件MEGA(ver.5.05)的UPGMA構建系統發育樹，各分支的置信度自舉檢測(bootstrap)1 000次。

1.6 Pcc亞種特異引物擴增基因

用Pcc特異性引物EXPCCF(5′-GAACTTCGCACCGCCGACCTTCTA-3′)和EXPCCR(5′-GCCGTAATTGCCTACCTGCTTAAG-3′)[9]擴增5個分離菌株pECC2F序列區域。25 μL的PCR反應體系：DAN模板1 μL(100 ng/L)，2×TaqPCR Master Mix 12 μL，上游引物1 μL(20 μmol/L)，下游引物1 μL(20 μmol/L)，加ddH2O至總體積25 μL。PCR擴增條件:94 ℃變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環；72 ℃延伸5 min。以2 000 bp DNA marker為分子質量標準，取4 μL PCR擴增產物進行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，核酸染料染色觀察是否有特異性條帶產生。選用本實驗室保存的果膠桿菌致病菌Pa(Pa11)為對照菌株。

2 結果與分析

2.1 軟腐病菌的分離和致病性測定

軟腐病病樣中分離的菌株經CVP選擇性培養基篩選，選擇在CVP培養基上生長的菌株向培養基內部擴展，形成杯狀凹陷(圖1-A)，將分離的菌株回接到宿主馬鈴薯塊莖上，塊莖組織從接種部位開始產生水漬狀病變并向接種點周圍迅速擴散(圖1-B)。其癥狀于田間采集的馬鈴薯軟腐病樣癥狀一致，對接種發病的馬鈴薯塊莖組織重新分離病原菌，得到的5個菌株均能引起馬鈴薯塊莖軟腐癥狀。

2.2 軟腐病菌的形態及生物化學特征分析

軟腐病病樣中分離的5個菌株經CVP選擇性培養基篩選，在CVP培養基上產生凹陷的菌株。將菌株轉接到LB固體培養基上，菌落形態呈圓形、乳白色、表面光滑，略隆起。革蘭氏染色呈陰性。所有測試菌株均可在37 ℃生長，具有耐鹽性，對紅霉素不敏感，能使明膠液化，過氧化氫酶反應呈陽性，蔗糖試驗還原反應、氧化酶和磷酸酶活性及吲哚產生試驗均呈陰性，不能利用D-麥芽糖、山梨醇、D-阿拉伯糖醇和α-甲基葡萄糖，但可以利用檸檬酸鹽、乳糖、纖維二糖、棉子糖和蜜二糖(表1)，這些結果與報道的胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種(P.carotovorumsubsp.carotovorum)的生物學形態特征和生理生化特性均吻合[4]。

圖1 菌株在CVP培養基平板上產生杯狀凹陷(A)和接種48 h后塊莖癥狀(B)Fig.1 Cup-shaped cavities formation of isolated pathogen from diseased tuber of potato in field on CVP agar (A) and symptom of healthy tuber at 48 h after in vitro-inoculation with pathogen (B)

2.3 16S rRNA的序列分析及系統發育樹構建

分離獲得的5個菌株QPB-4、QLL-10、QDM-7、QHX-4和QHL-2的16S rRNA基因經PCR擴增，均得到一條大小約為1.5 kb的片段(圖2)，與胡蘿卜軟腐病果膠桿菌16S rRNA基因的擴增片段大小近似，在NCBI數據庫中將測序結果與已知序列進行BLAST比對，結果表明，5個菌株與Pcc(KR054976.1)的16S rRNA基因序列的相似度(或一致性)均達99%。基于16S rRNA基因完整序列，以馬鈴薯黑脛病致病菌(Dickeyasolani)菌株ND14b為外組，將5個菌株的序列與已發表的38株軟腐菌菌株的序列構建系統發育樹(圖3)。結果顯示，本研究分離得到的5個菌株與已發表的Pcc菌株形成的類群構成明顯的分枝，已發表的Pcb與Pco菌株形成的類群構成獨立的分枝，Pa和Pb菌株共同組成的類群與Pw菌株組成的類群也聚集成另外分枝。

2.4 Pcc特異性引物擴增

用Pcc特異性引物EXPCCF和EXPCCR擴增5個菌株及其對照菌株。結果表明5個菌株中均擴增得到一條大小約為550 bp的特異性條帶(圖4)；而在對照菌株Pcb(BC1)中沒有得到擴增產物，由此可見，分離的5個菌株均被鑒定為Pcc。

表1 從田間病薯塊莖分離的5個菌株的生理生化特征Table 1 Physiochemical characteristics of 5 strains isolated from diseased tubers of potato plants in field

注：+.陽性反應；-.陰性反應。

Note：+ and - indicate positive and negative reactions.

M.DNA marker DL2000；1.無菌水用作陰性對照 Sterile water used as negative control;2.菌株QPB-4 Strain QPB-4；3.菌株QHL-2 Strain QHL-2;4.菌株QDM-7 Strain QDM-7; 5.菌株QLL-10 Strain QLL-10;6.菌株QHX-4 Strain QHX-4

圖2不同分離菌株16SrRNAPCR的瓊脂糖凝膠電泳
Fig.2Ethidiumbromide-stainedagarosegelelectrophoresisshowingPCRproductsamplifiedin16SrRNAgenesofdifferentstrains

2.5 軟腐病菌致病力測定

以馬鈴薯塊莖接種病原菌產生的病斑長度作為判定細菌的致病力。塊莖竹簽傷口接種后72 h時統計病斑長度，發現5個菌株之間不存在明顯的致病力差異，按病斑長度劃分為低、中和高等致病力。Pcc亞種之間的菌株致病力不存在差異，菌株QPB-4、QHX-4、QDM-7和QLL-10在接種后72 h時表現較強致病力，而菌株QHL-2表現為中等致病力。同時來自不同地區的菌株致病力差異也不顯著(表2)。

3 結論與討論

支點上的數字為 Bootstrap 生成的百分率，條形圖表示遺傳距離 The number at each branch points showed percentage supported by Bootstrap,bar indicated the genetic distance of evolutionary branches

圖35個菌株與其他菌株的16SrRNA基于序列構建系統發育樹
Fig.3Phylogenictreebasedonblastresultsof5strainsPectobacterium16SrRNAsequence

表2 5個Pcc菌株的采集地點及致病力等級Table 2 Sampling sites and pathogencity level of 5 Pcc strain collections

注：M.致病力中等；H.高致病力。

Note： M.moderate pathogenicity;H.high pathogenicity.

M.DNA marker DL2 000；1.無菌水用作陰性對照 Sterile water used as negative control; 2.菌株QPB-4 Strain QPB-4；3.菌株QHL-2 Strain QHL-2;4.菌株Pa(Pa11) Strain Pa(Pa11); 5.菌株QLL-10 Strain QLL-10;6.菌株QHX-4 Strain QHX-4; 7.菌株QDM-7 Strain QDM-7

圖4分離的5個不同菌株PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳
Fig.4Ethidiumbromide-stainedagarosegelelectrophoresisofPCRproductsamplifiedfrom5differentstraincollections

Pcc是自然條件下寄主種類眾多和地理分布最為廣泛的植物病原菌，能浸染溫帶和亞熱帶地區種植的馬鈴薯、白菜、甘藍、胡蘿卜、番茄、洋蔥、芹菜和黃瓜等數百種蔬菜，以及某些花卉植物，如馬蹄蓮、菊花、蘭花、蝴蝶蘭和君子蘭等[2]。馬鈴薯軟腐病是馬鈴薯生產上的重要病害之一，近年由于青海不斷擴大馬鈴薯種植規模，軟腐病在青海省的發生范圍也蔓延擴大。本研究通過對青海省馬鈴薯軟腐病的病原菌分離、形態觀察、致病性測定及16S rDNA基因序列比較，明確引起青海省馬鈴薯軟腐病的病原為胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)。該亞種引發馬鈴薯軟腐病，此后導致西椒、胡蘿卜和萬年青植物的軟腐病，也有巴西、摩洛哥等國家馬鈴薯軟腐病來源于該菌系[10-15]。5個菌株的形態表型特征與果膠軟腐桿菌(Pectobacterium)相似。進一步測定該病原菌的生理生化特征，包括過氧化氫酶、氧化酶產生、明膠液化、蔗糖還原、磷酸酶活性、吲哚產物、對紅霉素的敏感性、碳水化合物產酸、有機鹽產酸、37 ℃生長及50 g/L NaCl溶液中的生長情況，與胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種(Pcc)特征完全一致[4]。不同于Pa與Pw菌系低于36～37 ℃的生長特性，又有別于Pb菌系不能利用檸檬酸和明膠的特性，5個菌株與參試菌株Pall均可以在37 ℃和5 g/L NaCl培養基中正常生長，具備降解檸檬酸和明膠特征，這與Pc菌株表現一致，支持其屬于Pc種的歸類[16-18]。

DNA標記、血清學和DNA 雜交在許多植物病原細菌致病亞種和致病型區分方面有報道，其中16S rRNA序列分析是目前主要的細菌系統發育分類方法[19]。為了進一步明確病原菌的亞種分類地位，對測試菌株的基因組進行分析。通過對16S rRNA基因序列分析，結合Pcc亞種pECC2F序列特異性引物擴增，將分離得到的5個軟腐病菌均鑒別為Pcc。16S rRNA基因完整的序列分析及系統進化樹結果將分離得到的5個軟腐菌與已發表的Pcc菌系共同形成明顯的Pcc分支，且該分支中與Pco和Pcb歸為不同類群；利用Pcc亞種pECC2F序列的特異性引物在Pcc菌系中均擴增出1條大小約550 bp的Pcc特異條帶，而Pcb菌株無擴增產物。此外，EXPCC特異性引物擴增方法也可用于Pcb亞種的鑒定[20]。Onkendi等[21]報道用EXPCCF/EXPCCR特異性引物在Pcc菌系中擴增得到550 bp的特異性條帶，而Pcb中無擴增產物。Nabhan等[18]研究認為16S rRNA僅能區分細菌種的差異，而不能對亞種進行區分，但本研究在5個Pcc菌株中，有2個Pcc菌株與已發表的Pcc菌系聚集成由Pcc菌株構成的亞類群，而遺傳關系相對較遠的Pco和Pcb菌株單獨成群。可見，基于16S rRNA基因序列在一定程度上也揭示亞種之間的遺傳關系。

本研究致病力鑒定結果發現5個菌株不存在明顯的致病力差異，亞種內不同地區的菌株之間也不存在明顯的致病力分化。據文獻報道，馬鈴薯細菌性軟腐病多為Pcc亞種所致[10，12，22-24]。但本研究在青海省其他地區馬鈴薯軟腐病病樣中也分離到Pcb和Pco，用該亞種接種馬鈴塊莖莖亦能引起植株塊莖軟腐癥狀，但接種馬鈴塊莖莖軟腐程度不同，并且Pcb和Pco菌株占分離菌株的比例不高。因此引起青海省馬鈴薯軟腐病的病原主要是Pcc。關于Pcc與Pcb、Pco二者或三者在青海春種馬鈴薯產區的分布、擴散及復合浸染有待進一步研究。

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