圈養普氏野馬對夏季高溫生理應答的非損傷性研究

吉晟男， 肖能文， 鄧懷慶， 胡德夫

(1. 中國環境科學研究院生物多樣性研究中心，北京100012； 2. 貴州師范大學生命科學學院，貴陽550001；3.北京林業大學自然保護區學院，北京100083)

高溫通常被認為是一種不利的脅迫因子，會影響動物的生存活動(Farooqetal.，2010)。高溫應激會影響反芻動物的生長和繁殖(La Sallesetal.，2017)。溫度變化在動物的耐受范圍內時，動物可通過自身生理或行為的改變進行體溫調節，以適應不良的生活環境(Bernabuccietal.，2010)；當溫度變化超過了動物的耐受范圍，動物生理或免疫系統調節失常，嚴重的或死亡(Serbesteretal.，2005；Bohmanova，2006)。已有的高溫應激研究主要在經濟動物中，如綿羊Ovisaries、奶牛Bostaurus等(何世山，金小軍，2003；Renaudeauetal.，2008；Serbesteretal.，2012)；對野生動物的研究，僅見夏季高溫條件下生理狀況的簡單描述(Huberetal.，2003；Gesquiereetal.，2008)。

激素調節在動物應對高溫時起著非常重要的作用，尤其是糖皮質激素和三碘甲腺原氨酸(T3)(Maraietal.，2007；Renaudeauetal.，2008)。短期應激對動物有利，但長期的激素應激可能會損害動物的健康(Sapolsky，1998)。目前可以通過測定糖皮質激素和T3各自的代謝產物在血液、唾液和身體排泄物(如糞便)中的含量來判斷動物的應激狀況(Renaudeauetal.，2008)。在血液和唾液的采集過程中，對動物重復的捕捉和保定不可避免(Millspaugh & Washburn，2004)，對大型哺乳動物和瀕危物種而言難度較大。糞便相對容易采集且不會過度干預動物的行為，研究者可在遠處觀察目標動物，待其排便離開后再采集。這種非損傷性取樣方法在野生動物研究中已得到了廣泛應用(Creeletal.，2002；Keechetal.，2010；Dengetal.，2014)。

普氏野馬Equusprezwalskii是世界上僅存的野生馬種類，其野生種群在20世紀中期于中國和蒙古野外滅絕(Mohr，1971)，但其圈養種群使得這一物種得到保存(Ryder，1994)。在國際保護組織的努力下，普氏野馬圈養種群獲得了充足的發展，并嘗試放歸實驗以恢復野生種群(Ryder & Wedermeyer，1982)。中國于1985年在新疆維吾爾自治區籌建了第一個普氏野馬繁育中心，分別在德國和英國進行引種培育，由于該地歷史上曾經有野生種群分布，環境條件適宜，新疆普氏野馬繁育中心在社會和政府的共同努力下，圈養種群繁育狀況良好，種群數量不斷擴大，并成功放歸。新疆普氏野馬繁育中心位于中國西北部，冬寒夏熱，四季分明，最熱月(7月)氣溫可達50 ℃(陳金良，2008)。普氏野馬不可避免受到夏季高溫的影響，在此極端條件下，普氏野馬會產生怎樣的生理應答未見報道。高溫對圈養普氏野馬生理和行為產生的應激反應可能會影響其管護工作。鑒于此，本研究利用非損傷性取樣法對普氏野馬夏季高溫刺激的生理應答進行了監測，以期為科學的保護管理提供基礎資料。

1 研究方法

1.1 研究對象

選擇新疆普氏野馬繁育中心(89°14′～89°36′E，45°49′～46°04′N)5個家族群中的15匹成年個體，分為雄馬、雌馬和帶駒雌馬3組，每組5匹(表1)。研究時間為2011年7月4日—8月3日。采用隔日取樣法收集目標個體的糞便樣品，如果遇到極端高溫，則每天持續采樣，待高溫天氣結束后3～4 d，恢復隔日取樣法。為排除激素代謝產物水平的時間差異，所有待測樣品均于同一時間段(08∶00—10∶00)采集。在整個取樣期間，不改變普氏野馬的飼喂方式。

表1 實驗個體組別及年齡Table 1 Information of captive Equus prezwalskiiin the experiment

1.2 溫濕度指數

在飼養場中1.5 m處懸掛干濕溫度計，從08∶00開始，每隔1 h記錄一次溫濕度。利用每天最高溫度和最低相對濕度計算溫濕度指數(temperature-humidity index，THI)：

THI=db-[(0.31-0.31RH)(db-14.4)]

其中，db為溫度(℃)，RH為相對濕度(%)。當THI>28.9時，動物為高溫應激狀態(LPHSI，1990；Maraietal.，2001)。

1.3 樣品采集及檢測

跟蹤觀察目標個體，待其排便離開后，用一次性塑料手套收集糞樣上層新鮮部分，混合后用塑料自封袋保存，在袋上標記采集時間及個體，帶回基地后放于-20 ℃的冰箱內保存待測(Cavigelli，1999；Curtisetal.，2000)。

樣品激素測定參照M?stl等(1999)和Galama等(2004)的方法并略作改進。首先解凍樣品，然后取濕糞10 g進行冷凍干燥，取0.5 g干燥樣品粉碎后放于10 mL 80%甲醇中萃取，離心后取上清液，同時對剩余沉淀物進行二次萃取，離心后取上清液。合并2次收集的上清液進行水浴蒸干，用1 mL 80%甲醇溶解剩余固體并于-20 ℃保存。

采用放射性免疫法測定激素代謝產物水平。皮質醇及T3試劑盒(北京北方生物所)主要技術參數見表2。N-682型放射性免疫γ光子計數器(上海核福光電儀器有限公司)測定激素代謝產物水平，測定結果換算成單位干糞的激素水平(ng·g-1)。普氏野馬糞便激素水平平均具有24 h的延遲(曹婷婷，2008)，數據分析時，當日糞便激素水平對應為前日采集日期。

表2 試劑盒主要技術參數Table 2 Technical parameters of the kits

1.4 數據檢驗

運用SPSS 23.0(SPSS Inc.，Chicago，USA)對數據進行統計分析。THI作為分類變量(THI>28.9為高溫應激；THI≤28.9為非高溫應激)，整合不同類群普氏野馬的糖皮質激素代謝產物(fecal glucocorticoid metabolites，FGM)水平與T3代謝產物水平，同一類群當日糞便激素取均值對應前一天的THI。對比同一類群高溫與非高溫應激狀態下的激素差異，以及不同類群間激素水平差異。使用One Sample Kolmogorov-Smirnov Test對數據進行正態分布檢驗，多因變量一般線性模型(Multivariate tests of general linear model)做多因素方差分析，組別和應激程度作為固定因子，組間多重比較采用LSD，對比前檢驗數據方差齊性。數據結果以Mean±SE表示，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 夏季普氏野馬總體激素水平

繁育中心夏季炎熱干旱，夏季每日最高溫度和最低相對濕度幾乎同時出現，一般出現在每日的13∶00—18∶00，持續時間相對較長(圖1)。在整個夏季高溫期，普氏野馬都維持在一個較高的激素水平，FGM水平為161.30～237.19 ng·g-1，T3代謝產物水平為11.64～17.65 ng·g-1。

2.2 夏季高溫期普氏野馬FGM水平

圈養普氏野馬在夏季高溫期不同類群的FGM水平具有明顯差異(圖2)，雄馬組水平最高，為237.19 ng·g-1±10.24 ng·g-1；雌馬組水平居中，為208.34 ng·g-1±6.39 ng·g-1；帶駒雌馬組水平最低，僅為161.30 ng·g-1±5.01 ng·g-1。對3個不同類群的FGM水平進行多因素方差分析，結果表明，3組間的差異均有統計學意義(F2， 60=22.885，P<0.001)，具體為：雄馬vs.雌馬(MD=28.855，SE=11.163，P=0.012)、雄馬vs.帶駒雌馬(MD=75.899，SE=11.163，P<0.001)、雌馬vs.帶駒雌馬(MD=47.045，SE=11.163，P<0.001)。此外，以THI=28.9為界，將普氏野馬各組組內高溫應激與非高溫應激的FGM水平進行對比，多因素方差分析結果顯示，3組組內不同應激程度的FGM水平差異無統計學意義(F1， 60=0.233，P=0.631)，且組別與應激程度不存在交互作用(F2， 60=0.024，P=0.976)。

圖1 夏季高溫期日最高溫度、最低相對濕度及溫濕度指數Fig. 1 Daily maximum temperature， minimal relative humidity and temperature-humidity index during high temperature periods in summer

圖2 圈養普氏野馬不同類群夏季高溫期糞便糖皮質激素代謝產物水平Fig.2 Fecal glucocorticoid metabolites of Equus przewalskii in different groups during high temperature periods in summer

2.3 夏季高溫期普氏野馬T3代謝產物水平

圈養普氏野馬不同類群在夏季高溫期間T3代謝產物水平具有明顯差異(圖3)，雌馬組水平最高，為17.65 ng·g-1±0.59 ng·g-1，雄馬組居中，為14.76 ng·g-1±0.43 ng·g-1，帶駒雌馬組最低，僅為11.64 ng·g-1±0.33 ng·g-1。對3個不同類群的T3代謝產物水平進行多因素方差分析，結果表明，3組間的差異有統計學意義(F2， 60=37.780，P<0.001)，具體為：雄馬vs.雌馬(MD=-2.891，SE=0.662，P<0.001)、雄馬vs.帶駒雌馬(MD=3.120，SE=0.662，P<0.001)、雌馬vs.帶駒雌馬(MD=6.011，SE=0.662，P<0.001)。此外，以THI=28.9為界，將普氏野馬各組組內高溫應激與非高溫應激的T3代謝產物水平進行對比，多因素方差分析結果顯示，3組組內不同應激程度的T3代謝產物水平差異無統計學意義(F1， 60=0.333，P=0.566)，且組別與應激程度不存在交互作用(F2， 60=2.260，P=0.113)。

圖3 圈養普氏野馬不同類群夏季高溫期三碘甲腺原氨酸代謝產物水平
Fig.3 Fecal thyroid triiodothyronine metabolites ofEquusprzewalskiiin different groups during high temperature periods in summer

3 討論

極端溫度會影響動物生理狀況，動物亦可通過自身生理調節以適應不良生活環境(Bernabuccietal.，2010)。新疆屬于中國西北干旱地區，夏季炎熱，7月為當地夏季高溫期(陳金良，2008)，在此期間，普氏野馬肯定會受到高溫脅迫。本研究結果發現，普氏野馬在整個高溫期一直維持在較高的FGM和T3水平，遠高于冬季圈養雄馬的FGM水平(34.00 ng·g-1±5.14 ng·g-1)(曹婷婷等，2009)。但是，普氏野馬在夏季高溫期不同溫度下，生理應激程度的激素水平差異并不顯著，因此推測，新疆普氏野馬在應對夏季高溫脅迫時，其生理代謝水平會升高，并維持較高水平，但在其正常調節范圍內，沒有超過其耐受的閾值。普氏野馬生理代謝水平的升高可能是其抵御不利環境的必要保證(于小杰，2011；吉晟男，2013)。此外，LPHSI(1990)僅對畜禽類的高溫應激閾值給出統一值，即當THI>28.9時，畜禽類動物處于嚴重高溫應激狀態，并未針對動物個體大小進一步細分。Marai等(2001)將THI=28.9作為高溫閾值，應用于雌性穴兔Oryctolaguscuniculus的研究中，然而，將THI=28.9作為圈養普氏野馬高溫與非高溫的分界值還有待驗證。

動物身體的核心溫度超過正常范圍時，會導致身體總熱負荷(內環境)超過散熱能力，動物會通過生理或行為方式降低這種反應(Bernabuccietal.，2010)。已有研究發現，圈養普氏野馬在其他季節的休息時間和飲水頻次顯著低于夏季，且休息和飲水行為發生高峰期與夏季高溫時間一致(陳金良，2008；張峰，2010)。吉晟男等(2013)的研究表明，夏季高溫期普氏野馬偏好選擇迎風背陰處站立休息，且飲水和排尿次數增多；同時圈舍面積較小、缺乏足夠的庇蔭場所，為爭奪較好的庇蔭環境，普氏野馬的攻擊行為會增加。

本文研究結果顯示，圈養普氏野馬的FGM和T3代謝產物在夏季高溫期一直維持較高水平，不同類群間差異有統計學意義，總體上成年雄性及雌性的應激水平高于帶駒雌馬。這一結果也許不僅與性別或帶駒有關， 3組野馬間的年齡差異也可能影響結果，需要后續驗證。此外，在干旱地區，高溫往往與干旱同時共存，水資源的缺乏對野生動物生存影響更大(Krausman & Etchberger，1995；Maraietal.，2007)。陳金良(2008)研究發現，在新疆普氏野馬繁育中心的圈舍內缺乏大面積的地表積水，不利于普氏野馬伏水降溫。Marai等(2010)研究表明，野生水牛Bubalusarneearnee只有在樹蔭下或水中，并有風的情況下，體溫才能保持正常。鑒于此，為減少群內個體的爭斗，增加其個體生存的適宜度，建議夏季高溫期實行分組、分圈管護，優化圈舍環境，增大圈舍內積水面積，具體措施為：(1)分組、分圈管護，將帶駒雌馬和幼駒分離出家族群，合圈飼養。(2)搭建簡易遮陽棚，挖掘小面積水池，增設飲水槽，增加圈舍內積水面積和供水次數；降低水源因子的限制。(3)圈舍間設置障礙物，避免普氏野馬之間相互干擾和攻擊。

采用非損傷性取樣法對普氏野馬FGM和T3代謝產物水平進行監測，可定量評估圈養普氏野馬夏季高溫期的生理狀況，及時調整圈養種群的管護模式，降低高溫對普氏野馬的生理及行為影響，為該物種的管護提供數據資料。

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