LC—MS研究白芷中香豆素成分對多烯紫杉醇藥代動力學的影響

管詠梅+朱衛豐+管雪靜+廖正根+趙國巍+董偉+梁新麗

[摘要] 建立測定大鼠血漿中多烯紫杉醇LC-MS方法，并分別研究白芷中3個香豆素成分（歐前胡素、異歐前胡素及氧化前胡素）對多烯紫杉醇藥代動力學的影響。以紫杉醇為內標，血漿樣品經甲醇沉淀蛋白，LC-MS測定，方法經特異性、線性范圍、準確度、精密度、穩定性等確證適合用于血漿中多烯紫杉醇的測定。試驗采用每組6只大鼠，分別口服灌胃給予多烯紫杉醇（50 mg·kg-1）組、氧化前胡素（8 mg·kg-1）配伍多烯紫杉醇（50 mg·kg-1）組；歐前胡素（15 mg·kg-1）配伍多烯紫杉醇（50 mg·kg-1）組、異歐前胡素（15 mg·kg-1）配伍多烯紫杉醇（50 mg·kg-1）組。LC-MS測定給藥后血漿中多烯紫杉醇濃度，繪制血藥濃度-時間曲線，并用DAS 2.0軟件計算相關藥代動力學參數。結果顯示多烯紫杉醇與3個香豆素成分配伍前后其藥代動力學參數有了明顯的變化。血藥濃度-時間曲線下面積（AUC）顯著性增加，藥峰濃度（Cmax）顯著提高。表明白芷香豆素類化合物能促進多烯紫杉醇的口服生物利用度，三者對多烯紫杉醇口服生物利用度的影響作用氧化前胡素最強、異歐前胡素次之、歐前胡素最弱。

[關鍵詞] 多烯紫杉醇； 歐前胡素； 異歐前胡素； 氧化前胡素； 藥代動力學

[Abstract] The study was aimed to establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometric method for the determination of the docetaxel concentration in rat plasma， and study the effect of coumarin constituents （imperatorin， isoimperatorin and oxypeucedanin） in Angelica dahurica on pharmacokinetics of docetaxel.Plasma was precipitated with acetonitrile and determined by LC-MS method with Paclitaxel as an internal standard. The specificity， linearity， range， accuracy， precision and stability of the method were suitable for the determination of docetaxel in plasma.Six sprague-dawley rats in each group received intragastric administration of docetaxel （50 mg·kg-1）， oxypeucedanin （8 mg·kg-1） combined with docetaxel （50 mg·kg-1）， imperatorin （15 mg·kg-1） combined with docetaxel （50 mg·kg-1）， and isoimperatorin（15 mg·kg-1） combined with docetaxel （50 mg·kg-1）.Their drug plasma concentration was determined by LC-MS with Paclitaxel as an internal standard to draw plasma concentration-time curve， and the phamacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0. The results showed that the phamacokinetic parameters of docetaxel all had notable changes when combined with imperatorin， isoimperatorin， and oxypeucedanin， respectively. The phamacokinetic parameters AUC and Cmax were significantly increased， indicating that coumarin constituents in Angelica dahurica could promote the oral bioavailability of docetaxel， and their effects were in the following order： oxypeucedanin>isoimperatorin>imperatorin.

[Key words] docetaxel； imperatorin； isoimperatorin； oxypeucedanin； phamacokinetic

白芷為我國大宗常用中藥材品種之一，其收載于2015年版《中國藥典》一部[1]，具有祛風散寒、燥濕排膿、止痛等功效[2]，其活性組份主要為白芷香豆素和揮發油，前期研究結果表明白芷香豆素可促進配伍對藥活性成分如葛根素、黃苓苷等的腸道轉運[3-4]，同時發現白芷香豆素有規律的促進P-gp介導的藥物的腸道轉運，而且對P-gp的表達具有一定的抑制作用[5]。進一步采用體外Caco-2細胞模型考察了白芷中香豆素單一成分對P-gp介導藥物腸道轉運的影響[6]，研究結果表明白芷中歐前胡素、異歐前胡素及氧化前胡素可促進此類藥物的腸道轉運。P-gp是一種重要的藥物轉運蛋白，與藥物結合后，在其核苷酸結合位點上結合ATP，ATP水解后所釋放的能量使藥物泵出細胞外，導致藥物濃度下降，進而影響藥物吸收[7-8]。在腫瘤細胞中P-gp一般表達較高，其可降低細胞內的藥物濃度，導致腫瘤的多藥耐藥的發生。許多臨床一線廣泛使用的藥物均能引起腫瘤的多藥耐藥作用，如長春花生物堿類、紫衫烷類、多柔比星等。多烯紫杉醇是紫杉烷類的抗腫瘤藥物，是現有藥物中治療轉移乳腺癌和非小細胞癌最有效的單劑化療藥物。但其水溶性低[9]、口服生物利用度低[10]，進因而阻礙了其在口服制劑的應用。因此本文在此前研究基礎上，建立血漿中多烯紫杉醇LC-MS測定方法，進一步研究白芷香豆素中歐前胡素、異歐前胡素和氧化前胡素對多烯紫杉醇藥代動力學的影響。endprint

1 材料

1.1 藥品與試劑

多烯紫杉醇（西安昊軒生物科技有限公司，批號DXZSC-141229）；氧化前胡素對照品（上海融禾醫藥科技發展有限公司，批號100420）；歐前胡素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110826-200712）；異歐前胡素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110827-200407）。

1.2 儀器

AB 4500 QTRAP液質聯用儀（美國AB公司）；XW-80A渦旋混合器（上海青浦滬西儀器廠）；3-18K型高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；微量移液槍（美國Thermo公司）。

1.3 動物

SD大鼠，雄性，體質量180～200 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2011-0003。

2 方法

2.1 大鼠血漿中多烯紫杉醇LC-MS/MS分析方法的建立

2.1.1 多烯紫杉醇色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAXExtend-C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm），流動相A為乙腈，B為0.1%乙酸，梯度洗脫：0～1 min，30%～52% A；1～3 min，52% A；3～3.1 min，52%～70% A；3.1～5 min，70% A。柱溫25 ℃，體積流量為0.4 mL·min-1，進樣量為10 μL。

2.1.2 質譜條件 ESI離子源；正離子模式；多反應檢測方式（MRM）；測定多烯紫杉醇檢測離子為 m/z 802.4→527.2，紫杉醇檢測離子為 m/z 854.2→569.2；氣簾氣壓35 psi （1 pis=6.895 kPa）；噴霧電壓5 500 V；去簇電壓：多烯紫杉醇50 V，紫杉醇100 V；碰撞能量15 V；霧化器45 psi，平衡器45 psi。

2.1.3 血漿樣品的處理 室溫下水浴融化血漿，混勻，精密吸取100 μL，置于1.5 mL Eppendorf管中，依次加入20 μL空白甲醇，20 μL內標溶液，渦旋60 s，加入360 μL甲醇，渦旋3 min，16 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，按照2.1.2項質譜條件進樣檢測。

2.1.4 多烯紫杉醇儲備液與紫杉醇儲備液的配制 精密稱取定量的多烯紫杉醇對照品，甲醇超聲溶解定容到25 mL量瓶，作為儲備液。采用倍數稀釋法，分別得到質量濃度0.025 5，0.051 0，0.255，0.510，2.55，5.10，10.2 mg·L-1的系列工作液。精密稱取一定量的紫杉醇對照品，甲醇超聲溶解定容至25 mL。臨用時取出適量稀釋至質量濃度為200 μg·L-1。

2.1.5 特異性 取大鼠空白血漿100 μL，按2.1.3項下方法操作，大鼠空白血漿不加內標（紫杉醇）樣本、空白血漿加入內標樣本、空白血漿加入多烯紫杉醇樣本、給藥后大鼠血漿加入內標（紫杉醇）樣本，并記錄相應的色譜圖。

2.1.6 標準系列樣品和質控樣品的制備 精密移取SD大鼠空白血漿100 μL于1.5 mL離心管中，依次加入20 μL系列工作溶液，20 μL內標溶液，渦旋60 s，加入360 μL甲醇，渦旋3 min，16 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，備用。即得質量濃度為1.02，2.04，10.2，20.4，102，204，408 μg·L-1的標準系列樣品和1.02（LLOQ），2.04（QCL），20.4（QCM），204 μg·L-1（QCH）系列質控樣品。

2.1.7 標準曲線及線性范圍 取大鼠標準血漿系列樣品，采用2.1.1項LC-MS/MS條件進樣。以多烯紫杉醇的加入濃度C為橫坐標，以待測物As與內標Ai的峰面積比值（f=As/Ai）為縱坐標進行權重回歸（權重系數為1/C2）.

2.1.8 最低定量限與精密度和準確度 取多烯紫杉醇血漿質控系列樣品（LLOQ，QCL，QCM，QCH）每種質量濃度5份，按2.1.3項下操作，連續測定3 d，以隨行標準曲線計算最低定量限與質控樣品的濃度，將同一濃度3 d共18個樣品的實測濃度進行單因素方差分析，計算日內、日間精密度（RSD）和準確度（RE）。

2.1.9 提取回收率 取多烯紫杉醇血漿質控系列樣品（QCL，QCM，QCH）每種質量濃度6份，按2.1.3項下操作，用其進樣得到的峰面積除以未經提取處理的低、中、高3種相應質量濃度的多烯紫杉醇質控工作液及內標工作液后進樣得到的峰面積，計算血漿中多烯紫杉醇的提取回收率。

2.1.10 穩定性 考察多烯紫杉醇低、中、高3個質量控制濃度的血漿樣品在室溫放置6 h，-20 ℃下放置7 d以及-20 ℃下反復凍融3次的穩定性。

2.2 白芷香豆素對多烯紫杉醇在大鼠體內藥代動力學的影響

2.2.1 藥代動力學給藥方案 雄性SD大鼠隨機分成6組，實驗分3 d完成，每次實驗前至少12 h禁食不禁水。分別灌胃給予50 mg·kg-1多烯紫杉醇、多烯紫杉醇（50 mg·kg-1）配伍氧化前胡素（8 mg·kg-1）；50 mg·kg-1多烯紫杉醇、多烯紫杉醇（50 mg·kg-1）配伍歐前胡素（15 mg·kg-1）；50 mg·kg-1多烯紫杉醇、多烯紫杉醇（50 mg·kg-1） 配伍異歐前胡素（15 mg·kg-1）。分別于給藥后0.083，0.166，0.25，0.5，1，1.5，2，4，6，8，10，12 h眼眶靜脈叢取血0.5 mL，并置于1.5 mL肝素抗凝管中，4 000 r·min-1離心10 min，精密吸取上清液至1.5 mL EP管中，立即儲存于-20 ℃冰箱，備用。

2.2.2 數據處理 實驗數據采用DAS 2.0藥代動力學軟件處理，非房室方法計算藥代動力學參數。主要藥代動力學參數是由平均血藥濃度數據計算得到，Cmax和AUC的方差由軟件自帶的稀疏數據計算方法得到。endprint

3 結果

3.1 大鼠血漿中多烯紫杉醇LC-MS方法學考察

3.1.1 特異性 多烯紫杉醇及內標的峰形良好，保留時間分別為 2.85，3.19 min，大鼠空白血漿中的內源性物質不干擾測定，見圖1。

3.1.2 標準曲線與線性范圍 多烯紫杉醇在大鼠血漿中標準曲線方程為y=0.005 46x+0.013 4，R2=0.993 3，線性范圍2.040～408.0 μg·L-1。

3.1.3 最低定量限與精密度和準確度 多烯紫杉醇日內精密度RSD為4.1%～8.3%，日間精密度RSD為5.9%～10%，RSD均小于15%，重復性好，符合要求。準確度91.20%～97.80%。最低定量限（LLOQ）為1.02 μg·L-1（S/N>10），表明該方法靈敏度高，可用于多烯紫杉醇的微量分析。

3.1.4 回收率 多烯紫杉醇方法回收率為80.10%～92.90%，RSD為2.9%～9.4%，小于15%；內標的提取回收率83.50%～96.70%，RSD為5.2%。

3.1.5 樣品穩定性 多烯紫杉醇低、中、高3個濃度樣品室溫放置6 h后相對偏差RE為-10%～-1.7%，RSD≤8.9%。-20 ℃放置7 d后相對偏差RE為-7.3%～-2.6%，RSD≤9.3%。凍融3次后相對偏差RE為-0.40%～5.0%，RSD≤8.8%。表明多烯紫杉醇血漿樣品在上述條件下穩定。

3.2 白芷香豆素對多烯紫杉醇在大鼠體內藥代動力學的影響

多烯紫杉醇及多烯紫杉醇分別配伍歐前胡素、異歐前胡素及氧化前胡素后的大鼠體內藥代動力學參數見表1，血藥濃度-時間曲線見圖2～4。結果提示多烯紫杉醇配伍歐前胡素后AUC，Cmax及藥時曲線下面積均有所提高；多烯紫杉醇配伍異歐前胡素后AUC，Cmax及藥時曲線下面積顯著提高，其中AUC，Cmax分別為配伍前的1.3，1.5倍；多烯紫杉醇配伍氧化前胡素后AUC，Cmax及藥時曲線下面積顯著提高，其中AUC，Cmax分別為配伍前的1.7，1.5倍。

4 討論

目前許多藥物和活性成分因P-gp外排而使其口服生物利用度差，使得該類藥物難以開發成有效的口服制劑，甚至難以成藥，如具有較強藥理活性的柔比星、紫杉醇、長春新堿、芍藥苷等[11-12]。前期實驗結果表明白芷中歐前胡素、異歐前胡素及氧化前胡素對多烯紫杉醇的吸收促進作用。但上述研究是在體外細胞模型開展，本實驗基于體外細胞模型結果的可信度，采用體內藥代動力學分別驗證該3種成分對多烯紫杉醇體內過程的影響，結果證實白芷中香豆素對多烯紫杉醇P-gp介導的藥物有顯著促進作用。

實驗結果表明，多烯紫杉醇單獨給藥和分別配伍白芷中歐前胡素、異歐前胡素及氧化前胡素后，藥代動力學行為有明顯差異，差異主要表現在聯合給藥后的AUC，Cmax等參數上，聯合給藥后AUC，Cmax均較單獨給藥組顯著提高，歐前胡素、異歐前胡素對多烯紫杉醇t1/2無顯著影響，而氧化前胡素配伍多烯紫衫醇后t1/2下降，表明3種成分增加多烯紫杉醇生物利用度的原因與對消除率影響無關，可能是三者對介導多烯紫杉醇在體內外排作用的P-gp具有影響，或三者抑制了P-gp蛋白表達或其他原因導至其外排功能受到抑制，從而增加了多烯紫杉醇口服生物利用度。

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[責任編輯 張燕]endprint