細菌降解黃曲霉毒素B1的研究進展

嚴家俊，莊藝協，吳風霞，金佳佳，張 娟

（1.廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東 佛山 528300；2.中國水產科學研究院 南海水產研究所，廣東省漁業生態環境重點實驗室，廣東 廣州 510300）

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是一組由二呋喃環和香豆素的組成的結構類似物[1]，易溶于甲醇、丙酮和氯仿等有機溶劑，難溶于水。其主要是由黃曲霉（Aspergillusflavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等多種真菌產生的具有強毒性和致癌性的次級真菌代謝產物[2]，目前已發現的黃曲霉毒素有二十余種，常見的有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）毒性最強，具有強肝毒性，低劑量可抑制動物免疫機能，使消化系統紊亂，高劑量會誘發癌變甚至死亡，因而被世界衛生組織癌癥研究機構劃定為Ⅰ類致癌物質[3]。其廣泛分布于農產品及飼料食品中，加之因毒素污染導致動物中毒，不但對糧食和畜牧業造成嚴重的經濟損失，對人類及動物的健康也存在巨大的威脅。由于黃曲霉毒素所帶來的巨大經濟損失和健康危害，眾多研究學者致力于尋求有效的防治技術，其中生物防治是一種行之有效的方法。其中，研究發現微生物能夠降低黃曲霉毒素含量，其中包括細菌、真菌及酵母菌等。本文對細菌降解黃曲霉毒素B1進行綜述，并對其研究結果進行初步分析，以期為接下來的機理研究提供基礎材料。

1 黃曲霉毒素B1的去毒方法

國內外專家學者現已對AFB1去毒進行了大量的研究，主要有化學法、物理法和生物法[4]。物理脫毒方法主要包括吸附劑吸附法、水洗法、剔出法、脫胚去毒法、溶劑提取法、加熱去毒法和紫外線去毒法等，其中最常用的是吸附劑吸附法，但吸附劑吸附毒素的同時也會吸附飼料中的營養物質。化學脫毒的方法主要采用堿或氧化劑進行脫毒，包括石灰水浸泡法、氨水脫毒法以及氧化劑脫毒法，其基本原理是霉菌毒素在強酸或者強堿的作用下轉化為無毒的物質。然而這些方法存在效果不穩定、脫毒不完全、化學物質殘留會導致營養物質和微量元素的流失、難以規模化生產等缺點。而生物法主要包含生物吸附法和生物降解法。生物吸附法主要是微生物通過細胞壁吸附毒素而不是共價結合，死亡細胞仍具有結合能力。這種結合是一個可逆的過程，雖然能有效吸附毒素，但隨著培養時間的延長，部分毒素會重新釋放到培養基質中。而生物降解主要是將AFB1的毒性基團分解破壞，同時產生低毒或者無毒的降解產物的過程，是一種化學反應的過程，完全不同于吸附結合作用。

2 菌株發酵條件對降解黃曲霉毒素B1的影響

微生物的物質代謝和能量代謝受外界環境條件（如溫度、pH值及培養基組成等）的影響較大。適宜的外部條件不僅對菌體的生長有利，還可以提高其對底物的利用能力，使其代謝反應向著有利于合成目標產物的方向進行。因此會出現菌體具有AFB1降解能力，但是降解率不夠高的情況。針對這一問題，眾多學者對發酵條件進行優化研究，以期達到提高AFB1降解率的目的，為目的菌株的工業化應用提供參考。李俊霞等[5]通過對目的菌株進行發酵培養基和培養條件優化，黃曲霉毒素的降解率從84.2%升高至94.29%，優化效果明顯。戴軍等[6]通過單因素試驗，對目標菌株產酶發酵條件進行優化，所得最佳條件為裝液量50 mL/250 mL，發酵周期48 h，初始pH5.0，接種量8%，發酵溫度37℃，搖床轉速160 r/min。在最佳發酵條件下，該菌株發酵上清液中的酶活性比優化前提高了23.7%。楊文華等[7]在單因素試驗的基礎上，通過3因素3水平的Box-Behnken響應面分析法優化施氏假單胞菌發酵產AFB1降解酶的條件。在優化后的條件下，酶活力比優化前提高了28.99%。王寧等[8]通過單因素試驗和正交試驗對一株具有降解AFB1活性的黏細菌的產酶條件進行優化，得到最優的培養基以及培養條件，在最佳培養基和最佳發酵條件下，該菌株降解AFB1的能力為78.2%。劉睿杰等[9]采用響應面法研究巨大芽孢桿菌固態發酵去除花生粕中AFB1的發酵條件，確定其最佳條件為料水比1∶1.1，發酵溫度35.90℃，發酵時間64.32h。在此條件下，AFB1降解率可達68.54%。

3 細菌降解黃曲霉毒素B1的作用機理研究

目前，針對細菌降解AFB1的研究發現，其主要作用機理是通過分泌降解酶與食品中的毒素反應，從而達到解毒的目的。本文將從細菌降解AFB1的作用機理出發進行綜述，通過對細菌胞內酶降解、胞外酶降解等方面研究結果進行歸類分析，為接下來的研究提供基礎。

3.1 胞外酶降解

關心等[10]以香豆素為唯一碳源，通過初篩和復篩，從雞糞中分離出一株蔬菜芽胞桿菌，其上清液AFB1降解率可達83%，排除其胞體的吸附作用，初步推斷其降解活性成分為細胞代謝產生并分泌至胞外的活性物質。TENIOLA OD等[11]研究發現，紅串紅球菌的胞外提取物在30℃的溫度條件下對AFB1的降解率在90%以上，同時依據胞外提取物在熱處理和蛋白酶處理后降解率大大降低，推斷解毒過程為酶促反應。針對紅串紅球菌，ALBERTSJF等[12]也有相同的發現。中國農業大學動物營養國家重點實驗室分別從發霉糧食、動物糞便、土壤等樣品中提取篩選出26株降解黃曲霉毒素的菌株，其中嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、橙紅色粘球菌（Myxococcus fulvus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）、短波單胞菌（Brevundimonas sp.）、霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）、短狀桿菌、纖維菌（Cellulosimicrobium sp.）和炭疽芽孢桿菌（Bacillusanthracis）降解率均＞75%。在最佳發酵條件下，橙紅色粘球菌對AFB1的降解率達到80.7%。運用蛋白分離純化技術分離純化出MADE酶，分子質量大小為32 kDa，該酶在pH 6、35℃時活性最佳。而通過篩選優化的枯草芽孢桿菌的發酵上清液對AFB1的降解率達到80%[13-16]。孫玲玉[17]從泰山土壤中篩選出具有較高降解AFB1作用的枯草芽孢桿菌，命名為枯草芽孢桿菌泰山株，其發酵后上清液對AFB1的降解活性最高，通過對解毒活性物質進行加熱和蛋白酶K變性處理后，解毒活性顯著降低，表明起解毒作用的活性物質是其分泌的一種胞外酶。戴軍[18]以香豆素為唯一碳源從不同樣品中篩選到27株能高效降解AFB1的微生物菌株，通過以不同菌株發酵上清液中AFB1降解酶活力高低為復篩條件，篩選到AFB1降解酶活性最高的一株菌株，經形態學、生理生化及系統發育學方法鑒定為Sinomonas sp.，并初步推斷該酶為菌株分泌的胞外酶。這是國內第一次報道該菌屬的菌能降解AFB1。徐銘乾等[19]從霉變花生粕中篩選出一株能高效降解AFB1同時抑制黃曲霉生長的菌株Bacillusamyloliquefacuens HSP-5，該菌株所產生的降解AFB1物質為胞外物質，通過非誘導作用產生，其對AFB1不同含量的霉變花生粕樣品降解率均達到80%以上，且降解后樣品中AFB1含量＜30μg/kg，符合國家對飼料中AFB1含量的限量要求。這些特性為其在食品等工業生物防治黃曲霉以及降解AFB1具有很高的研究價值。雷元培等[20]對枯草芽孢桿菌降解黃曲霉毒素的生物活性、抗菌性以及抗逆性進行研究，結果表明，起解毒作用的是一種胞外酶，同時對分泌的活性蛋白具有強解毒活性，特異性和作用效果溫和等特點，適用于去除飼料中的黃曲霉毒素。FARZANEH M等[21]發現枯草芽孢桿菌UTBSP1對黃曲霉毒素具有較高的降解率，并通過實驗研究證明這種降解反應受胞外酶的酶促反應調控。

細菌胞外酶對AFB1的降解作用在已有研究中顯示出較高的降解率，均可達70%以上，甚至可高達90%以上。但對其降解后的研究均未深入進行，其降解后的產物是無毒的還是低毒的也未進行闡明，此外，如何提高胞外酶的純度和產量，也是亟待解決的問題，因此有必要繼續深入研究從而促進其廣泛應用。

3.2 胞內酶降解

李超波等[22]成功從動物糞便中分離2株高效降解AFB1的菌株，其上清液作用甚微，而滅活細胞卻失去活性，從而推測AFB1被胞內活性物質降解。李文明[23]通過不同培養及降解條件，研究了施氏假單胞菌F4對AFB1的酶解作用，并對降解產物進行了分離鑒定及致突變性測定，結果表明施氏假單胞菌F4能夠降解AFB1的活性物質為生物酶，且該酶為非誘導性胞內酶。王雪妍等[24]從土壤中提取一株食醚紅球菌，并通過薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）和酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）實驗證明，該菌能降解AFB1，其含有的還原酶FDR家族蛋白FDR_Adt很可能是負責降解AFB1的功能。

細菌降解AFB1的主要活性物質是降解酶，根據其分泌后排放位置分為胞外酶和胞內酶，胞內酶的降解作用研究發現相對胞外酶的研究發現較少，細菌降解AFB1的作用機理是否主要是通過胞外酶的酶促反應，這一推斷還需大量研究實驗加以證明。

3.3 其他

李俊霞等[25]同樣是以香豆素為唯一碳源篩選出了AFB1降解菌株嗜麥芽窄食單胞菌，后期毒理學試驗證明活菌制劑在2.56×1010CFU/mL劑量以下不會引起急性毒性反應。岳曉禹等[26]通過對嗜麥芽窄食單胞菌菌體細胞溶液、胞內物質和胞外粗提液對AFB1進行降解實驗，結果表明，其胞外粗提液的降解能力最強，降解率達到78.64%，胞內物質基本無降解能力，由此可知，該菌株降解AFB1的主要物質為來自胞外的代謝產物。張志敏等[27]從秦川牛瘤胃內容物中分離到一株降解AFB1的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），當接種量為5%和AFB1質量濃度為500μg/mL時，其降解率可達79%。該研究團隊隨后又從豬腸道及內容物中分離出一株甲基營養型芽孢桿菌，在相同條件下，降解率達到75.25%[28]。孫曉霞等[29]從農田、糧庫、牛場的300個樣品中篩選出AFM1降解率達到78.6%的菌株，并通過細胞形態、生理生化反應等鑒定該菌株為纖維化纖維微菌（Cellulosimicrobium cellulans），首次發現了纖維化纖維微菌對AFM1的降解功能。

上述研究雖然均篩選出降解菌株，但未對其降解機理進行相關研究或闡述，黃曲霉毒素是被降解還是被吸附也未置可否。對于乳酸菌，據現有的文獻報道，其去毒機理主要是依靠菌體細胞的物理吸附，而不是實質的生物降解作用[39-45]。而吉小鳳等[30]從肉雞腸道中篩選到一株乳桿菌屬的脫毒菌株，對約14μg/L的AFB1去毒率達到63.4%，HAMIDIA[31]分別從人體糞便和鮮奶中分離得到乳酸菌Lactobacillus pentosus和Lactobacillus beveris，并通過實驗證實這兩種菌對AFB1都具有一定的毒素結合能力。此外，AFB1于乳酸菌可通過形成復合物，降低AFB1對人體的危害，且復合物更容易排除體外，減少AFB1在人體內的積累[32]。雖然降解率相比已有研究報道不高，但考慮到其屬于益生菌群，生物安全性高，因此具有一定的應用價值。

4 黃曲霉毒素B1降解菌活性產物的應用研究

在利用細菌降解AFB1的研究中，重點探討了菌株的篩選和降解條件優化方面的研究，而在作用機理研究、降解產物結構分析和安全性評價等方面研究成果較少。岳曉禹等[26]對嗜麥芽窄食單胞菌降解AFB1活性產物的應用性質進行了初步研究，表明其來自胞外的代謝產物，分子質量大小為30 kDa，并確定了該活性物質的最適應用條件。RAO K R等[33]利用地衣芽孢桿菌CFR1的胞外成分對AFB1進行降解。并通過高效薄層色譜法（high performancethin layer chromatography，HPTLC）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和電噴霧質譜（electrospray ionization massspectrometry，ESI-MS） 分析發現，降解產物熒光性消失，這表明AFB1由于內酯環裂解被生物轉化成與其結構不同的物質。LIU D L等[34]通過對假密環菌降解AFB1的研究發現AFB1被黃曲霉毒素氧化酶氧化為環氧化物，接著水解為AFB1-8,9-二氫二醇，最后打開呋喃環。CAOH等[35]也從假密環菌中純化、鑒定黃曲霉毒素氧化酶，并通過HPTLC分析表明該酶打開了AFB1中的呋喃環。YU J[36]研究發現微生物降解AFB1過程中，會產生一種發熒光的化合物AFB2a（又稱AFB1-W）[37]。TEUNISSONDJ等[38]通過向1日齡體質量為50 g的鴨子注入1200μg AFB2a，發現鴨子并未產生于其他黃曲霉毒素相同的癥狀，且AFB2a的毒性為AFB1的1/200。

5 展望

利用細菌對黃曲霉毒素進行高效降解進而減少并控制黃曲霉毒素的危害，具有環保、高效、無毒害等優點，是解決黃曲霉毒素污染的有效途徑及研究熱點。目前國內外使用細菌降解黃曲霉毒素在食品工業中的應用才剛剛起步。雖然近年來取得一定的研究成果，但是在研究中，多數更關注的是脫除菌株的篩選及脫除條件的優化。對降解產物的安全性以及降解菌株環境耐受性等方面的研究相對較少，若能有效地改善細菌脫除黃曲霉毒素過程中周期普遍較長以及在不同環境中脫除能力不穩定等問題，并將其應用到食品工業生產中。細菌對黃曲霉毒素的降解技術將會具有更重要的實際應用價值。

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