除蟲菊莖腐病原菌的分離和鑒定

袁丁

除蟲菊莖腐病造成植株由莖基部開始向上變褐、腐爛，后期發展到花葉，整株枯死。本文采用柯赫氏法則，結合菌落、孢子形態等顯微特征及ITS序列比對分析，首次證明除蟲菊莖腐病主要由禾生鐮孢菌直接侵染引起，尖孢鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、厚垣鐮孢菌亦可從傷口侵入致病。

除蟲菊是一種古老的天然殺蟲菊科植物。它含有高效殺蟲而對人畜無害的活性成分，如其中除蟲菊素廣泛用于生產殺蟲劑和蚊香。隨著規模化種植面積擴大和連年種植，病害日益突出，如除蟲菊莖腐病危害嚴重，部分田塊幾近絕產，已成為除蟲菊產業發展的瓶頸。初期，植株莖基部褐色至黑色腐爛，后期，部分側枝甚至整株莖、葉、花全部黑褐色腐爛枯死。由于種植范圍不廣，除蟲菊病害還未得到廣泛關注，許多病原尚不清楚。本文從除蟲菊莖腐病發病部位分離和鑒定了病原，旨在為制訂該病防治策略提供理論依據。

1材料與方法

1.1病原菌分離

除蟲菊莖腐病樣本來自云南省峨山縣雙江鎮福泉村。病原菌的分離采用常規組織分離法。從病株上剪下病健交界處，沖洗干凈，切取1～2mm×1～2mm的組織，用70%酒精消毒30秒，再用0.1%濃度的升汞溶液消毒1～5分鐘，然后用無菌水沖洗3次，每次1～2分鐘，最后移植于PDA培養基平板上，置于25℃恒溫條件下培養。待長出菌絲后，在菌落邊緣用無菌接種針挑取菌絲塊移至PDA培養基中，繼續放入25℃恒溫5d，再置于4℃冰箱內貯存備用。

1.2病原菌純化

使用稀釋法純化病原菌。將初步純化的病原菌轉移至CLA（康乃馨葉片煎汁培養基）和SNA（Spezieller N？hrstof-farmer Agar）培養基上，25℃、12小時光照黑暗交替培養，期間保持病原菌氧氣充足，5-15天后，顯微鏡下觀察其產孢情況。挑取已產孢的菌落，加入1-2mL滅菌水后，用滅菌牛角匙刮取孢子于滅菌水中，吸取孢子懸浮液分級稀釋，并各吸取1mL均勻涂在加入氯霉素的PDA培養基上，25℃培養48小時。挑取單菌落菌株培養。

1.3致病菌篩選

除蟲菊采用漂浮育苗法培養，發芽后移栽至沙土基質中，按照柯赫氏法則，將純化后的真菌用牙簽接種法插入除蟲菊幼苗基部，或菌株培養物土壤接菌的方法接菌，將培養4天，長滿菌絲的較薄PDA培養基與滅菌基質混勻，以無菌PDA培養基與基質混勻做對照，覆蓋除蟲菊種子育苗，待幼苗長出后即可觀察發病情況。植株發病后，從植株發病部位重新分離病原菌，最終篩選出致病真菌。

1.4菌株形態鑒定

1.4.1菌落形態觀察

挑取純化后的菌絲，移至直徑10cm培養皿的PDA培養基中央，25℃、12小時熒光/12小時黑暗培養96小時后，測量菌落直徑，并利用色譜卡觀察比較培養基色澤，重復10皿。25℃下繼續培養15天，觀察是否有菌核產生。

1.4.2分生孢子形態特征觀察

將純化后的菌株轉移至CLA或SNA培養基上，25℃、12小時熒光/12小時黑暗培養4-15天后，挑取菌絲，用無菌水制片，觀察其產生的分生孢子類型，記錄30個大型和小型分生孢子的形態、大小、隔膜數、有無足細胞。為了觀察和計算菌絲及孢子，加酸性品紅于10%氫氧化銨溶液中制片，蓋玻片用兩層指甲油涂抹封邊。

1.5 rDNA ITS序列擴增與測序

采用何月秋的CTAB法[5]提取鐮孢菌株的DNA，以真菌通用引物ITSI （5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC 31進行rDNA ITS序列PCR擴增。擴增程序為：94℃預變性10 min；94℃變性1 min；55℃退火1min；72℃延伸2min；共25個循環；72℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳確認后送深圳華大基因研究院純化測序。

1.6菌種的鑒定

將測序得到的DNA序列與NCBI數據庫比對的同時，用DNAman、EditSeq等軟件對DNA序列比對分析，并用MEGA等分析軟件，以Maximum Likelihood法（1000 repeti-tions）構建分子系統樹，并結合形態特征，參照Booth形態學分類系統進行種的鑒定。

2結果與分析

2.1除蟲菊莖腐病癥狀

除蟲菊莖腐病一般從莖基部、根部開始腐爛，幼苗可見莖基部葉片黑色或褐色腐爛，后期部分側枝甚至整株莖、葉、花全部黑褐色腐爛枯死，最終導致整株死亡，影響十分嚴重。

2.2致病鐮孢菌的形態鑒定

從供試病株中分離到4種鐮孢菌：禾生鐮孢菌、蓮生尖孢鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、厚垣鐮孢菌致病，且以禾生鐮孢菌為主，它可通過菌培養物土壤接菌法直接致使除蟲菊發病，而其他3種鐮孢菌可通過傷口侵染。

2.2.1禾生鐮孢菌（F.cerealis）的形態（編號D41）在PDA平板上培養96h后，菌落平均直徑4.45cm，其邊緣稍不規則，菌絲白色絮狀，菌落中央呈橘黃色或棕黃色，外緣白色，后期菌落棕色。未見大型分生孢子，小型分生孢子棍棒狀，大多有兩個隔膜，大小為（7.7-15.3）μm×（2.3-3.5）μm。產孢細胞以芽生的方式產生分生孢子。

2.2.2蓮生尖孢鐮孢菌（F.oxyspomm f.sp.nelumbicola）（編號D47）在PDA平板上培養96h后，菌落平均直徑6.05cm。菌絲白色絮狀，由于大量分生孢子生成而呈粉質。小型分生孢子卵形。腎型或橢圓形，通常沒有隔膜，極少數有1個隔膜，大小為（5-10）μm×（2-5）μm。大型分生孢子在CLA培養基上大量產生，在SNA培養基上也會生成。大型分生孢子鐮刀形，少許彎曲，多數為3隔，大小為（18.8-48.9）μm×（2.4-4.6）μm。

2.2.3禾谷鐮孢菌（F.graminearum）（編號D49）在PDA培養基上96h后，菌落平均直徑大于9cm。菌絲白色，菌落呈玫瑰紅色。實驗室培養條件下未見小型分生孢子，大型分生孢子呈鐮刀形，有隔膜2-7個，頂端鈍圓，基部有明顯足細胞。大小為（2.8-6.2）μm×（38.7-64.3）μm。endprint

2.2.4厚垣鐮孢菌（F.chlamydospomm）（編號D50）在PDA平板上培養96h后，菌落平均直徑5.48cm。菌落邊緣整齊，菌絲白色稠密，菌落淺粉紅色，中央顏色較深，后期菌落顏色變為棕黃色。未見小型分生孢子，大型分生孢子月牙形短粗壯，有隔膜2-3個，基部無足細胞，大小為（2.8-5.3）μm×（15.8-21.2）1xm。

2.3致病菌株ITS序列的測定與親緣關系樹的構建

分離純化的菌株ITS序列與NCBI數據庫比較的結果：分離的禾生鐮孢菌、蓮生尖孢鐮孢菌同源性為99%，禾谷鐮孢菌、厚垣鐮孢菌同源性為100%。依據ITS序列與已知菌序列構建親緣關系樹狀圖可知：D41與禾生鐮孢菌親緣關系較近，為一類鐮孢菌，其與其他類型的鐮孢菌親緣關系較遠；D47、D49及D50分別于蓮生尖孢鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、厚垣鐮孢菌親緣關系較近，分屬于相應的鐮孢菌，其結果與同源比對結果相同。

3討論

除蟲菊在最初引入玉溪市范圍內種植時，病害很少。隨著種植年限的增加，病害越來越重，其中以莖腐病導致產量損失尤其突出。本研究結合形態學和ITS序列比對分析，鑒定出了4種鐮孢菌與該病害有關，其中Fusaritma cerealis以培養物土壤接種，便可引起田間相同的癥狀，具有很強的侵染能力；Fusarium oxysporum f. sp.nelumbicola，F.graminearum，F.chlamydosporum只是在有傷口時才引起發病，侵染能力較弱。然而，在自然條件下，這后三者是否與前者復合侵染，且是否加重病害，還有待繼續研究。

禾生鐮孢菌多分離自小麥、大麥的根部和谷粒，也可在薊等植物上分離到，但其引起的病害報道較少，本文第一次報道其能侵染除蟲菊，引起莖腐病。蓮生尖孢鐮孢菌常被認為存在于水中及沙質土壤中，引起蓮藕腐敗病，未見到侵染除蟲菊的報道，這可能與除蟲菊種植范圍不廣，受關注的程度不夠有關。實際上除蟲菊亦在沙質土壤上生長較好，它侵染除蟲菊引起莖腐病還是有可能的。禾谷鐮孢菌能侵染小麥引起赤霉病，侵染玉米引起穗腐病，是禾谷類常見的一類病原菌。厚垣鐮孢菌可引起瓜類、茄科、蘋果、香蕉、棉、豆科及花卉等植物病害，是常見的土傳病原真菌。這兩種鐮孢菌還未見到其侵染除蟲菊的報道。然而，鐮孢菌常存在專化型，即同種鐮孢菌在不同植物上致病性存在很大差異，這些侵入除蟲菊的鐮孢菌是否為除蟲菊致病專化型，還有待進一步試驗證實。

真菌的ITS序列常作為分類的一種輔助手段，但正確分類還要與形態特征等性狀相結合。本研究的D47和D49兩菌株的形態特征相差很大，前者產生鐮刀形大孢子和卵圓形小孢子，菌落白色絮狀、粉質，后者僅產生大型分生孢子，菌落呈玫瑰紅色，中央有黃色菌絲圈。兩者ITS序列分別與F.oxysporum f.sp.nelumbicola和F.graminearum同源性分別為99%和100%，但聚類分析時，D47與D49親緣關系比較相近，難以區分。本研究依據孢子形態、菌落特征，參考ITS序列信息，D47和D49分別被鑒定為F.oxysporumf.sp.nelumbicola和F.gramineamm。endprint