隱丹參酮對乳腺癌MDA—MB—231細胞遷移、侵襲的影響及其機制

周南陽+趙虹

[摘要] 目的 探討隱丹參酮對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移、侵襲的影響及其機制。 方法 用不同濃度的隱丹參酮處理 MDA-MB-231 細胞24 h。采用 MTT、劃痕實驗和Transwell侵襲實驗測定不同濃度隱丹參酮對MDA-MB-231細胞活性、遷移和侵襲的影響。采用Western blot檢測MDA-MB-231細胞中c-Src、p-c-Src Tyr416、FAK、p-FAK Tyr576/577、MMP2蛋白表達水平。 結果 與0 μmol/L對照組相比，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L隱丹參酮組對 MDA-MB-231 細胞存活率顯著降低，且呈劑量依賴（P<0.05）。與對照組相比，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L隱丹參酮組對MDA-MB-231 細胞遷移、侵襲率均顯著降低，且呈劑量依賴（P<0.05）。Western blot結果顯示，與對照組相比，不同濃度組經隱丹參酮處理的 MDA-MB-231 細胞，MMP2蛋白水平和 c-Src、FAK蛋白的磷酸化水平均顯著下調（P<0.05）。 結論 隱丹參酮可抑制三陰乳腺癌MDA-MB-231 細胞活性、遷移和侵襲，其機制可能與其下調c-Src/FAK通路和MMP2表達有關。

[關鍵詞] 隱丹參酮；乳腺癌；MDA-MB-231細胞；遷移；侵襲

[中圖分類號] R273 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）35-0016-05

[Abstract] Objective To investigate the effects and molecular mechanism of Cryptotanshinone on migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells. Methods MDA-MB-231 cells were treated with different concentrations of Cryptotanshinone for 24 h. The effects of Cryptotanshinone on cell viability， migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells were assessed by MTT assay， wound healing assay and Transwell invasion assay. The protein levels of c-Src， p-c-Src Tyr416， FAK， p-FAK Tyr576/577， MMP2 were detected by Western blot. Results The results showed that 5 μmol/L， 10 μmol/L， 20 μmol/L， 40 μmol/L Cryptotanshinone groups significantly reduced the viability ability of MDA-MB-231 cells in a dose-dependent manner， compared with the control group（P<0.05）. 5 μmol/L， 10 μmol/L， 20 μmol/L Cryptotanshinone groups significantly inhibited the the abilities of migration and invasion of MDA-MB-231 cells in a dose-dependent manner， compared with the control group（P<0.05）. The result of Western blot showed that Cryptotanshinone inhibited the expression of MMP2 and the phosphorylation of c-Src、FAK in a dose-dependent manner in MDA-MB-231 cells（P<0.05）. Conclusion These results suggest that Cryptotanshinone may suppress the viability， migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells by inhibiting c-Src/FAK pathway and the expression of MMP2.

[Key words] Cryptotanshinone； Breast cancer； MDA-MB-231 cells； Migration； Invasion

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率逐年增加，目前居女性癌死亡率的第一位[1]。其中，全世界每年約1000 000乳腺癌新增病例中超過17%的患者為三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）[1-2]。三陰性乳腺癌是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）與人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor- 2，Her-2）均為陰性的一類乳腺癌[1-3]。由于其惡性程度和侵襲性高，易在短期內復發轉移，且其對雌、孕激素受體表達陽性和Her-2過表達的乳腺癌的靶向治療不敏感，因此生存率比非三陰性乳腺癌差[2-3]。目前，三陰性乳腺癌治療方法研究成為國際上乳腺癌研究的熱點之一[1-3]。隱丹參酮（cryptotanshinone）是從唇形科植物丹參根中提取分離的二萜醌類有效單體，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種生物學活性和藥理效應[4-5]。近來文獻報道，隱丹參酮具有抑制乳腺癌細胞增殖、遷移等作用，然而有關隱丹參酮對乳腺癌細胞遷移和侵襲的作用及其機制目前尚不完全清楚[6]。本研究以三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞為研究對象，用不同濃度隱丹參酮干預，檢測其活性、遷移和侵襲能力，檢測遷移、侵襲相關分子基質金屬蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）表達水平和c-Src 激酶、黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）磷酸化水平，從而觀察隱丹參酮對MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的影響，并初步探討其機制，現報道如下。endprint

1 材料與方法

1.1 材料來源

乳腺癌 MDA-MB-231細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；隱丹參酮購自成都曼思特生物科技有限公司（純度>98%）（圖1）。將隱丹參酮溶于DMSO配制成等20 mmol/L的儲備液，分裝后于-20℃儲存，避光保存；使用時用無血清 RPMI 1640 培養液稀釋為5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L的工作液，DMSO終濃度為 0.1%，對照組為含0.1% DMSO的細胞培養液。胎牛血清和 RPMI 1640 培養基購自Hyclone 公司；兔抗人 c-Src、p-c-SrcTyr416、FAK、p-FAK Tyr576/577、MMP2和 β-actin 抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG購自 Cell Signaling Technology公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自美國Bio-Rad公司；Transwell 小室購自Corning公司；Matrigel基質膠購自美國 BD 公司；結晶紫染色液和RIPA裂解液購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 乳腺癌 MDA-MB-231 細胞在37℃，5% CO2條件下，常規培養于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培養基。待細胞長滿至80%左右單層時，用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液進行消化、傳代，取生長良好的細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞活性 取MDA-MB-231細胞，接種于96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，細胞數1×104/孔，每組5個復孔。培養 24 h后，吸棄原培養液，各孔分別加入 200 μL 含有不同濃度隱丹參酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L），同時設調零孔。繼續培養24 h后，利用 MTT 法在波長 490 nm 處檢測各組樣品吸光度值（A490）。細胞存活率=（實驗組A值-對照組A值）/（對照組A值-空白組A值）×100%，對照組定義為 100%。實驗重復3次。

1.2.3 細胞劃痕遷移實驗 取對數生長期MDA-MB-231細胞，接種于6孔板，1×106/孔，待細胞長滿后，更換為不同濃度隱丹參酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）繼續培養24 h。然后用20 μL槍頭于每孔中間做一劃痕，用PBS將未貼壁的細胞洗去，加入2 mL無血清 RPMI 1640 培養液，劃痕后24 h，于顯微鏡下拍照并計數遷移細胞數量，對照組定義為100%。實驗重復3次。

1.2.4 Transwell侵襲實驗 取對數生長期MDA-MB-231細胞，接種于6孔板，1×106/孔，待細胞融合至 80%時，更換為不同濃度隱丹參酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）繼續培養24 h。預先將基質膠用RPMI1640 培養基以 1：7～1：8 稀釋后，每個小室內加入 50 μL，4℃風干過夜，然后小心吸出小室內殘余液體，每孔加 50 μL無血清培養液，置于 37℃孵箱內，放置 30 min備用。取密度為 4×105/mL的各組細胞懸液100 μL加入上室內，每組均設復室。在下室中加入600 μL含10%FBS的RPMI 1640培養基，37℃，5%CO2培養箱中孵育24 h。取出Transwell小室，用棉簽擦去上室內的細胞和基質膠，用PBS清洗兩遍，4%的多聚甲醛固定液固定 30 min，1%結晶紫溶液中染色15 min，PBS 洗滌3次，風干，取下Insert膜，封片后在顯微鏡高倍鏡下，隨機選取10個視野，對侵襲至膜背面的細胞總數進行計數并拍照，取均值。對照組定義為 100%。實驗重復3次。

1.2.5 Western blot檢測蛋白水平 取對數生長期MDA-MB-231細胞，接種于6孔板，1×106/孔，待細胞融合至80%時，更換為不同濃度隱丹參酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）繼續培養24 h，收集細胞，4℃預冷的PBS洗滌3次，加入75 μL細胞裂解液，冰上裂解30 min，提取細胞總蛋白，bradford法測蛋白質濃度。取25 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉移至 PVDF 膜，用5%BSA/TBST封閉液室溫下封閉1 h，洗膜后加入抗 c-Src、p-c-SrcTyr416、FAK、p-FAK Tyr576/577、MMP2和 β-actin-抗（1∶1 000稀釋），4°C孵育過夜，TBST 洗膜3次，加入二抗（1∶1 000 稀釋）室溫下孵育2 h，TBST洗膜3 次，將化學發光增強液A和B等體積混勻涂抹于PVDF膜上，用Bio-Rad凝膠成像系統獲取圖像。實驗重復3次。

1.3 統計學方法

采用 SPSS 17.0統計學軟件對數據進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 校正的t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 隱丹參酮對MDA-MB-231細胞活性的影響

用MTT法檢測隱丹參酮對MDA-MB-231細胞活性的影響，結果顯示，在隱丹參酮作用24 h后，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組對MDA-MB-231細胞活性的抑制率分別為（12.22±1.04）%，（22.93±0.83）%，（37.51±1.00）%，（50.59±0.48）%。與對照組相比，各濃度隱丹參酮組對MDA-MB-231細胞存活率顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。兩兩比較結果顯示，各濃度之間差異有統計學意義（P<0.05），表明隱丹參酮可顯著抑制MDA-MB-231細胞活性，且呈劑量依賴（圖2）。endprint

2.2 隱丹參酮抑制MDA-MB-231細胞遷移情況

用劃痕實驗檢測隱丹參酮對MDA-MB-231細胞遷移的影響。結果顯示，隱丹參酮處理后，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L組對MDA-MB-231細胞遷移的抑制率分別為（29.01±1.85）%，（51.23±4.05）%，（68.72±2.49）%。與對照組相比，各濃度隱丹參酮組對MDA-MB-231細胞遷移率顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。兩兩比較結果顯示，各濃度之間差異有統計學意義（P<0.05），表明隱丹參酮可顯著抑制MDA-MB-231細胞遷移，且呈劑量依賴（圖3）。

2.3 隱丹參酮抑制MDA-MB-231細胞侵襲情況

用Transwell侵襲實驗檢測隱丹參酮對MDA-MB-231細胞侵襲的影響。結果顯示，隱丹參酮處理后，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L組對MDA-MB-231細胞侵襲的抑制率分別為（58.00±4.30）%，（68.10±1.94）%，（78.09±2.05）%。與對照組相比，各濃度隱丹參酮組對MDA-MB-231細胞侵襲率降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。兩兩比較結果顯示，各濃度之間差異有統計學意義（P<0.05），表明隱丹參酮可顯著抑制MDA-MB-231細胞侵襲，且呈劑量依賴（圖4）。

2.4 隱丹參酮對MMP-2蛋白表達及c-Src、FAK蛋白磷酸化的影響

用Western blot檢測隱丹參酮對MDA-MB-231細胞遷移、侵襲密切相關分子MMP2 表達水平和c-Src、FAK磷酸化水平。結果顯示，在隱丹參酮作用24 h后，與0 μmol/L對照組相比，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L組MDA-MB-231細胞中MMP2 表達水平和c-Src、 FAK蛋白磷酸化水平均顯著下降（P<0.05），且各濃度之間差異有統計學意義（P<0.05）（圖 5、表1）。

3 討論

隱丹參酮是中藥丹參根中提取的二萜醌類有效單體，因其具有菲并呋喃結構且D環上C15與C16之間為單鍵而呈現獨特的藥理活性，且其藥動學特征符合二室開放模型，是近年來國內外學者對中藥單體中研究較多的活性成分之一[7]。已有實驗證實，隱丹參酮可有效抑制腫瘤細胞增殖、侵襲，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制血管生成，從而發揮其抗腫瘤的作用[4]。新近研究報道，隱丹參酮可通過抑制MMP2和MMP9的表達抑制卵巢癌細胞遷移、侵襲，通過激活Caspase信號途徑誘導卵巢癌細胞凋亡[8]。Shen L等[9]研究發現在體內外肝癌模型中，隱丹參酮可通過下調STAT3蛋白磷酸化，增加了Bcl-2的表達，降低了Bax的表達，從而增強三氧化二砷誘導肝癌細胞凋亡。本研究結果表明，隱丹參酮在體外可顯著抑制三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞活性、遷移和侵襲，且呈劑量依賴性。Western blot結果表明隱丹參酮顯著抑制 MDA-MB-231細胞中c-Src和FAK 蛋白的磷酸化，同時下調MMP2蛋白表達，初步揭示了隱丹參酮抑制乳腺癌 MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的分子機制。目前有動物實驗結果表明，在人肺癌裸鼠原位移植模型中，隱丹參酮能有效抑制腫瘤形成，誘導其凋亡，同時改善機體狀況[10]。有關隱丹參酮體內抑制乳腺癌細胞侵襲和轉移的有效性與安全性有待進一步研究。另有文獻報道，隱丹參酮可通過STAT3信號誘導膽管癌細胞、腎癌細胞凋亡[4]，有關隱丹參酮對乳腺癌MDA-MB-231細胞的影響及其機制有待進一步研究。

c-Src是一種非受體型的酪氨酸激酶，由原癌基因 c-Src編碼，分子量約為 60 kDa[11]。在正常細胞中，c-Src處于抑制狀態；在癌變或處于有絲分裂期的細胞中，c-Src羧基端的Tyr530去磷酸化和Tyr 416自身磷酸化，使c-Src蛋白被完全活化。活化的 c-Src 將 FAK 磷酸化，然后二者形成復合物，誘導黏著斑翻轉，介導肌動蛋白重塑，促進細胞遷移和侵襲[12]。c-Src在多種腫瘤細胞中高度活化和/或過量表達，如肝癌、胃癌、結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌等[13]。研究發現，三陰乳腺癌常伴有c-Src的激活和過表達，與三陰乳腺癌的轉移和進展密切相關[14]，而沉默 c-Src 基因表達可抑制人三陰乳腺癌 MDA-MB-231細胞遷移和侵襲[15]。在本研究中，我們發現5 μmol/L 隱丹參酮可顯著抑制MDA-MB-231 細胞c-Src和 FAK 磷酸化水平，且隨濃度增加作用增強。提示隱丹參酮可能通過下調c-Src/FAK通路抑制MDA-MB-231 細胞遷移、侵襲。

MMP2是基質金屬蛋白酶家族的重要成員，其基因位于人類染色體16q21，分子量約為72 kDa，它能降解細胞外基質及基底膜，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉移中起關鍵性作用[16-17]。大量臨床研究和實驗研究表明，MMP2的高表達與腫瘤的轉移及預后密切相關，如乳腺癌、胃癌、肺癌、胰腺癌等[16-18]。有文獻報道，下調MMP2 的蛋白表達可有效抑制 MDA-MB-231細胞遷移和侵襲[19-20]。在本研究中，我們發現5 μmol/L隱丹參酮可顯著抑制MDA-MB-231細胞MMP2的表達，且隨濃度增加作用增強。提示隱丹參酮可能通過下調MMP2表達抑制MDA-MB-231細胞遷移、侵襲。

綜上所述，隱丹參酮可抑制三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞活性、遷移和侵襲，其機制可能與其下調c-Src/FAK通路和MMP2表達有關。本研究結果為隱丹參酮抗三陰乳腺癌的中藥分子治療提供了新的依據和線索。

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（收稿日期：2017-09-11）endprint