宏基因組學在乳及乳制品應用中的研究進展

胡婕，劇檸

(寧夏大學農學院，銀川750021)

0 引 言

宏基因組(m etagenom e)[1]，指的是環境中所有微生物遺傳物質的總和。宏基因組學(m etagenomics)[2]則是通過收集環境樣品并提取樣品中的優質DNA來構建宏基因組文庫，通過高通量測序，對測序結果進行數據分析來研究樣品中微生物的一種方法。宏基因組學解決了實驗室條件下大量微生物難以培養或不可培養的難題，縮短了實驗時間，具有高效性、準確性等特點。

目前，科研工作者常使用二代測序[3]和三代測序的高通量測序技術[4]來完成微生物宏基因組學的研究。二代測序主要是指Roche公司的454技術、illumina公司的Solexa，H iseq技術以及ABI公司的Solid技術。三代測序以H elicos公司的Helicos Genetic Analysis技術、PacBio公司的SM RT技術和O xford N anopore公司的納米孔單分子技術代表。宏基因組學技術應用于乳品行業，為研究乳及乳制品中微生物的多樣性和群落演替情況，發揮著重要作用。

1 干 酪

干酪是指在乳中(也可用脫脂乳或稀奶油等)加入適量的乳酸菌發酵劑和凝乳酶，使乳蛋白質凝固后，排除乳清，將凝塊壓成所需形狀而制成的產品[6]。國內學者近年來運用宏基因組學技術對少數民族傳統自然發酵干酪中的微生物進行研究，對其菌群多樣性進行了挖掘。呼斯楞[7]從哈薩克斯坦的阿拉木圖市和江布爾州兩個地區采集了6份由當地牧民通過自然發酵制成的傳統干酪，采用宏基因組學研究方法中的SM RT三代測序技術和傳統分離鑒定技術對樣品干酪中的細菌多樣性進行分析。研究結果表明：宏基因組學技術中得到傳統干酪中的細菌分屬14個門的94個屬144個種或亞種；其優勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes 92.46%)，優勢菌屬為乳酸桿菌屬(Lactobacillus 42.12%)，優勢菌種分別為乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis 28.93%)和瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus26.43%)；彌補了傳統方法僅分離得到了瑞士乳桿菌的失誤，從而可快速、準確地反映出微生物的群落特征，全面客觀地分析樣品中微生物的多樣性。焦晶凱，莫蓓紅[8]使用Illumina MiSeq二代測序技術，對來自內蒙古呼倫貝爾哈吉、陳巴爾虎旗、東烏珠爾以及西烏珠爾4個地區，由當地牧民經過自然發酵而制成的不同干酪樣品中的微生物多樣性進行統計同時對不同樣品間物種差異進行詳盡分析。研究結果表明：4個干酪樣品共分離出了432個菌屬，主要包括乳酸桿菌屬、醋酸桿菌屬(Acetobacter)和乳酸球菌屬(Lactococcus)；相比較土壤、海洋等樣品，干酪的微生物豐度曲線較窄，干酪中的菌種較為單一，而豐度曲線的斜率較大，4個干酪樣品中存在著優勢菌種，且通過菌落組成分析可知4個干酪樣品的優勢菌分別為乳酸桿菌、乳酸球菌和醋酸菌；PCo A分析可知，地域的差異對4個干酪樣品的微生物菌群分布組成有較大影響。

國外對干酪及干酪制品的食用更為普遍，對干酪的研究更早，也更為深入和廣泛。A lexandre Ceugniez[9]等人為研究法國Tomm e d'O rchies干酪中微生物的多樣性組成，采用宏基因組學中的Illumina二代測序技術，對真菌的5.8S rDNA的ITS2域進行測序。結果表明，Tomm e d'O rchies干酪中含有耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica)和白地霉(Galactomyces geotrichum)；該干酪中還發現了一些少見的微生物如：葡萄牙棒孢桿菌(C lavispora lusitaniae)、單胞釀酒酵母(Kazachstania unispora)和芽枝霉菌(C ladosporium cladosporioides)；同時，宏基因組結果也顯示了克魯維酵母屬(K luyveromyces)和德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)的存在。A lm eida[10]等人為降低成本且適用于宏基因組分析，采用illumina二代測序技術對從干酪制品中分離出的分屬67個屬137個種的142株細菌進行了測序。通過測序，重建了117個細菌的基因組草圖，建立了一個基因組參考目錄，包括從公共數據庫中分離出的克魯維菌屬(K luyvera)、黃球菌屬(Luteococcus)和嗜鹽乳酸菌屬(Marinilactibacillus)。為了證明這一新建基因組參考目錄的價值，分析了兩種涂抹干酪和一種藍紋干酪表面的微生物成分，得出這些干酪中的微生物很大一部分是由新建基因組參考目錄得到的，這有助于對干酪特性進行研究。除對干酪中的微生物群落多樣性展開研究外，學者對干酪生產過程中的微生物群落變化也展開了深入研究。A lessandra Dalm asso[11]等人采用Illumina二代測序技術對意大利Plaisentif半硬質干酪的生產進行了跟蹤研究。結果發現在干酪的生乳期、凝乳期微生物尤其是細菌多樣性較高，變形菌門和厚壁菌門含量最高；干酪成熟前期、成熟后期微生物多樣性較低，主要為厚壁菌門中的乳酸菌屬和鏈球菌屬(Streptococcus)，且多為乳酸菌。干酪制作的4個時期，均存在變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門、擬桿菌門(Bacteriodetes)、不動桿菌門(acinetobacter)。A lejandro[12]等人利用R oche公司的454二代測序技術對墨西哥Poro干酪的生產進行了跟蹤研究，通過高通量測序研究其微生物多樣性。結果發現，生乳期，微生物的細菌多樣性最高，包括球菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、乳酸菌屬和水棲菌屬；乳清期、凝乳期和干酪期的微生物多樣性較低，主要包括鏈球菌屬和乳酸菌屬，且凝乳后，豐度最高的是嗜熱鏈球菌和德氏乳酸桿菌。一些細菌，如葡萄球菌屬(Staphylococcus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、溶桿菌屬(Lysobacter)、乳酸球菌屬和腸球菌屬(Enterococcus)等則會偶有出現。近年來，學者將宏基因組技術與其他技術相結合，深入研究干酪一些特性的形成機制。Wolfe等人[13]采用宏基因組學技術研究了3種不同表面形態共137種干酪的表面微生物群落結構，從中分離培養出細菌和真菌共24株。該研究首次同時對如此多種類干酪的進行微生物研究，揭示出部分微生物的某些特殊功能與干酪的表面特性形成相關，假交替單胞菌(Pseudoalteromonas spp.)可產生甲硫氨酸γ-裂解酶；通過原位和體外重構研究，重現了干酪的發酵過程，確定物種間的相互作用和微生物的群落演替，提供用一種簡單模型來研究干酪發酵過程中真菌和細菌間的作用機制[14]。A lejandra Escobar-Zepeda[15]等人通過Illumina二代測序技術對墨西哥手工Cotija干酪中的優勢細菌和豐度進行究，同時通過高通量測序技術來研究干酪中微生物的代謝能力。經研究分析發現，Cotija干酪中的優勢細菌主要為乳酸菌、明串珠菌屬(T richococcus)和魏斯氏菌屬(W eisteria)；在細菌和古生菌的31種屬中均發現有超過500種非主要的微生物種屬，并且干酪中未發現沙門氏菌(Salmonella)、單胞菌(Monoucleosis)、布魯氏菌(Brucella)及分支桿菌(M ycobacterium)等致病菌的存在；此外，Cotija干酪中的微生物組也具有合成多種風味化合物的代謝能力，主要涉及的是支鏈氨基酸和游離脂肪酸的新陳代謝，以及一些與細菌產生和免疫有關的基因也相繼被發現?；蚪M學技術和代謝組學技術的共同應用不僅可以研究Cotija干酪中微生物的多樣性和微生物群落演替規律，也可以研究作為各種代謝路徑的底物和產物的小分子代謝物(MW＜1000)。

2 酸乳

酸乳是普通牛乳經過巴氏殺菌，冷卻到一定溫度后，接種乳酸菌，再經過發酵而賦予特殊風味的一種乳制品[16]，它是眾多的發酵乳制品中最原始、產量最大的品種。目前我國學者對酸乳的研究工作主要從酸乳中微生物的多樣性開展。智楠楠[17]等人采用宏基因組學中的Illuminna二代測序技術來分析9種市售酸奶中的微生物多樣性。通過測序發現樣品酸奶中的主要微生物是厚壁菌門，占酸奶中微生物總數的99.6%。而厚壁菌門中主要為鏈球菌屬(87.1%)、乳桿菌屬(10.3%)、乳球菌屬(0.3%)，并且9種酸奶中有3種酸奶同時含有鏈球菌屬和乳桿菌屬，其余6種酸奶中幾乎為鏈球菌屬(＞97%)，表明不同酸奶菌種的同質化程度較高且鏈球菌屬在酸奶中為優勢菌屬。張敏[18]等人采用llumina二代測序技術對新疆克州和塔城地區的酸牛奶、酸駝奶、酸馬奶以及自然發酵酸奶中細菌群落組成和微生物多樣性進行研究。研究結果表明：酸奶樣品中的細菌Shannon-W iener指數較高；不同動物酸乳的菌落組成存在較大差異，說明不同動物的體內所含有的微生物種類不同，但4種酸乳樣品中的菌群都以厚壁菌門為主；在屬水平上，酸牛奶、酸駝奶和酸馬奶中都是以乳桿菌屬為主。

開菲爾(kefir)是以牛乳或羊乳為原料，經數十種乳酸菌、酵母菌以及醋酸菌發酵而來復合型發酵酸乳[19]。開菲爾中含有嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳桿菌(Lacto-bacillus casei)、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paraca-sei)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等多種益生菌，具有較好的益生功能[20]。高潔[21]等人對滅菌的蒙牛脫脂乳中接入開菲爾粒，采用宏基因組學的Illumina二代測序技術研究其中的微生物多樣性。樣品中的微生物被鑒定到8個屬，分別為乳球菌屬(74.13%)，醋酸菌屬(Acetobacter 9.86%)，乳桿菌屬(Lactobacillus 5.01%)，鏈 球 菌 屬 (4.87%)，希 瓦 氏 菌 屬 (Shewanella 1.27%)，明串珠菌屬 (Leuconostoc 0.49%)，假單胞菌屬(Pseudomonas0.37%)和不動桿菌屬(Acinetobacter 0.04%)，且乳酸菌屬為優勢菌群；此外，樣品中有0.06%的序列沒有被鑒定出結果，但隨著進一步的實驗，這些尚未被發現的細菌是否具有安全性也可作為研究的一個重點方向。U fuk N albantoglu[22]等人采用R oche公司的454焦磷酸二代測序技術對兩種開菲爾乳中的微生物多樣性進行研究。研究結果表明：這兩種開菲爾中的微生物菌落表現出高度的一致性，其中乳酸菌屬是最為豐富的菌屬，其含量分別為99.42%和99.79%，并且兩種乳酸菌屬中的開菲爾基質乳桿菌(Lactobacillus kefir)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)和瑞士乳桿菌三種菌種之和分別占乳酸菌屬的97.63%和98.74%。楊曉娟[23]對開菲爾豆酸奶直投式發酵劑進行研究。使用開菲爾母液分別接種純豆奶、純豆奶與純牛奶比為1：1、純牛奶的3種原料，采用宏基因組學技術中的測序技術對3種發酵酸奶中的微生物進行測序。研究結果表明：在屬水平上，3種酸奶中的主要微生物依次為乳球菌屬、醋酸桿菌屬、乳酸桿菌屬和鏈球菌屬；此外，3種酸奶中乳酸桿菌屬存在顯著性差異(P＜0.05)，混合豆乳發酵酸奶中乳桿菌屬為6.34±0.02%，約為純牛奶發酵酸奶的2.5倍，純豆奶發酵酸奶的4.5倍，乳球菌屬、醋酸桿菌屬和鏈球菌屬差異不顯著(P＞0.05)。

3 原料乳

原料乳通常指的就是生鮮乳[24]，即從動物乳房擠出的未經過任何處理的生奶。張敏[18]等人采用llumina二代測序技術對新疆克州和塔城地區的牛奶、駝奶、馬奶、羊奶4種原料乳中細菌群落組成和微生物多樣性進行研究。結果表明：原奶樣品中的細菌Shannon-W iener指數較低；不同動物的原料乳的菌落組成存在較大差異，說明不同動物的體內所含有的微生物種類有所不同，但4種原料乳樣品中的菌群都以變形菌門為主；在屬水平上，牛奶中的微生物群落是以假單胞菌屬(Pseudomonas)為主，駝奶中的微生物群落主要為埃希菌屬-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)，馬奶中的微生物群落主要為明串珠菌屬，羊奶中微生物群落中國的優勢菌屬為乳球菌屬。此外，實驗還發現原料乳中的環境污染菌和條件致病菌的豐度都較高，說明這7種乳樣受到不同程度的污染，提出為提高乳品品質，應從乳品生產、加工、運輸、貯藏等各個方面嚴格把關。對于冷藏中的原料乳，Conor J.Doyle[25]等人采用Illumina二代測序技術對原料乳中的微生物進行宏基因組學研究，通過研究冷藏溫度為(2℃、4℃和6℃)和存儲時間(96 h)對散裝乳罐原料乳(BTM)的影響來評估季節性、貯藏時間和貯藏溫度對混合原料奶中微生物組成的影響。研究結果表明：溫度和時間對原料乳中微生物變化影響小，泌乳階段對原料乳中微生物變化影響大。Raquel Lo[26]采用高通量測序研究了較低的CO2壓力下原料乳的菌群多樣性，通過454焦磷酸二代測序技術和illumina二代測序技術的比較，說明對于同一樣品兩者結果具有高度的相似性，最終實驗結果表明較低的CO2壓力結合4℃冷藏可將原料乳保質期延長至少7天。李玲[27]等人從廣西的3個牛場中采集到了高質量的水牛原料乳，采用Illumina二代測序技術對原料乳中的微生物群落及其動態變化進行研究。研究結果顯示原料乳中含有大量微生物，且在儲存過程中，原料乳中微生物種群數量也隨時間推移而發生變化，其中乳酸菌屬和鏈球菌屬在24 h之內占據主要優勢，當存儲時間達72 h以上時，假單胞菌和不動桿菌屬為優勢菌屬，占原料乳整個微生物群落數的60%以上。這項研究表明：水牛原料乳在擠出后應當立即冷藏，并在運輸過程中及時檢測其中有無類芽孢桿菌的產生。

4 其他乳制品及乳飲料

4.1 巴氏殺菌乳

巴氏殺菌乳(pasteurized milk)，簡稱巴氏乳或市乳，是由新鮮牛乳為原料，經過巴氏殺菌法處理后直接供給消費者飲用的商品乳[28]。巴氏牛乳的處理方法比較溫和，較好地保存了牛乳的營養與天然風味，在殺滅牛乳中的致病菌的同時，幾乎不會對牛乳原本的色、香、味等產生多大的副作用，最大限度地保留牛乳原有的特質與風味[29-30]。李玲[27]等人從廣西的3個牛場中采集到了高質量的水牛原料乳，采用Illumina二代測序技術對巴氏殺菌乳中的微生物群落及其動態變化進行研究。研究結果為：巴氏殺菌乳中含有種類繁多的微生物，在儲存過程中，巴氏殺菌乳中微生物種群的數量也隨著時間推移而發生變化，優勢菌群由乳酸菌屬(7 d)變為類芽孢桿菌(21 d)。這項研究表明：巴氏殺菌法應當在收集完原料乳的24 d內進行，因為此時原料乳中嗜冷菌數相對較低。

4.2 UHT乳

UHT[31]（U ltra H igh Tem perature treated）是采用135～150℃，4～10 s，進行超高溫瞬時滅菌（以完全破壞其中可以生長的微生物和芽孢），然后在無菌狀態下進行包裝，以最大限度地減少牛乳在物理、化學以及感官上變化的一種鮮奶處理的滅菌工藝。由于UHT乳[32]的超高溫瞬時滅菌可以殺死乳中的大量微生物，使得乳中微生物種類和數量都大大減少，因此國內外學者將宏基因組學應用于UHT乳上的研究較少，主要是利用宏基因組學技術來檢測UHT中的少量微生物，從而保持乳品品質。黃衛強[33]等人選用國內兩種品牌的UHT乳為研究對象，以Illumina二代測序對UHT乳樣中微生物宏基因組DNA的16S rRNA基因v1-v3可變區擴增產物進行序列測定，根據序列的相似性進行OTU s劃分。結果表明：兩種品牌的UHT乳樣中的微生物主要為厚壁菌門，擬桿菌門，變形菌門，以及放線菌門(Actinobacteria)；而在屬水平的微生物群落結構顯示，兩個UHT乳樣中的微生物多樣性豐度存在差異，但是差異并不顯著。宏基因組學技術的應用，使得UHT乳中微生物被快速準確檢測，節約人力、物力，從而能夠提高乳品的品質，提升產品效益。

5 展 望

食物中的微生物群落通常被認為是低豐度的，因此，相比其他領域，宏基因組學在乳及乳制品方面甚至食品領域研究較少。然而，隨著測序技術及生物信息學技術的發展，近年來宏基因組學越來越多的被用于乳及乳制品中，研究微生物群落結構及其演替規律，深度挖掘出傳統培養方法無法獲得的微生物信息。此外，宏基因組學結合蛋白質組學、代謝組學技術等其他組學技術，研究乳及乳制品中微生物與營養、代謝組份及環境條件變化的關系，深刻揭示乳及乳制品品質變化機制將成為未來的研究趨勢。