納米載藥系統應用于缺血性腦卒中的研究進展Δ

吳雅云，龐鑫，劉剛（廈門大學公共衛生學院，福建廈門361102）

腦卒中是一種由于腦部血管突然破裂或因血管阻塞導致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的疾病，主要分為缺血性腦卒中（又稱為“腦梗死”）和出血性腦卒中，臨床上以缺血性腦卒中為多見，其發病率約占腦卒中的80%以上[1]。目前，缺血性腦卒中的臨床最佳治療方法是溶栓治療，即在發病后4.5 h的最佳治療時間窗內靜脈注射抗血栓藥物以溶解血栓，從而恢復腦部血流灌注[2]。然而，由于最佳治療時間窗較短，大部分患者無法及時接受有效治療；此外，溶栓療法也有引起再灌注損傷和出血等風險[3]。許多臨床前研究表明，神經保護劑（如抗氧化劑、細胞凋亡抑制劑）等藥物在治療缺血性腦卒中方面具有較好的效果，然而血腦屏障（BBB）的存在使得大部分神經保護類藥物無法進入腦部發揮療效[4]。

BBB是存在于腦組織和血液系統之間的生理屏障，能夠有效阻擋有毒物質入腦，為腦組織維持了相對穩定的內環境，但同時也阻斷了大部分藥物進入腦組織發揮對腦部疾病的治療作用[5]。將藥物遞送入腦的傳統方法包括經鼻給藥、將藥物改造成親脂性前藥、破壞緊密連接蛋白使得BBB暫時打開等，但都有其各自的不足之處：經鼻給藥在鼻屏障完好的條件下無法入腦；小分子藥物通過酯化修飾后可入腦，但容易被BBB上的外排泵通道排出腦外；打開BBB使藥物入腦的同時也可能導致有毒物質入腦而引發其他疾病。基于此，開發新的載藥系統以更有效地將藥物遞送到腦缺血病灶區，已成為當前缺血性腦卒中治療領域的研究熱點。

近年來，納米載藥系統的迅速發展為治療缺血性腦卒中提供了新的契機。納米載藥系統由于其尺寸小、比表面積大、水溶性較好、能進行靶向修飾等特點，成為了優良的腦部載藥系統[6]。理想的能透過BBB的載藥系統應該具有如下優點：釋放可控性、不破壞BBB、生物可降解性、靶向性、入腦藥物濃度可達到有效范圍[7]。而通過設計和修飾后的納米載藥系統能基本符合上述要求。此外，納米載藥系統不僅能夠裝載疏水性或親水性藥物以及基因藥物，還能夠進行影像學探針的標記[8]，使其既能治療缺血性腦卒中，也能對其進行示蹤成像。目前關于缺血性腦卒中的載藥系統的研究多見于國外文獻，故筆者以“Nanoparticles”“Ischemic stroke”“Brain”“Nanomedicine”“Liposome”“Imaging”等為關鍵詞在 PubMed、Elsevier等數據庫上查找2010年1月-2017年10月的相關文獻。結果，共檢索到相關文獻1 115篇，其中有效文獻49篇，并以此綜述納米載藥系統用于缺血性腦卒中的研究進展，為新型藥物制劑的研發提供參考。

1 缺血性腦卒中的病理特點

缺血性腦卒中所引起的腦損傷是一個動態過程：在急性期，氧和能量供應的匱乏引起一系列應激反應，使得活性氧自由基（ROS）和細胞因子上調并激活小膠質細胞和星形膠質細胞，隨后膠質細胞分泌細胞因子破壞BBB完整性，中性粒細胞等白細胞遷移進入腦實質，使得炎癥反應加劇，進一步引起腦水腫、BBB損傷和神經元死亡；在慢性恢復期，巨噬細胞進入腦缺血區參與神經元的再生[9-10]。

缺血性腦卒中的發病機制主要有：（1）ROS損傷：ROS是體內氧分子的反應產物（如過氧化氫、羥自由基等），缺血性腦卒中發生后腦損傷側有大量ROS產生，打破了氧化平衡，引起氧化應激，過量的ROS會損傷細胞內的大環分子，引起細胞自噬和凋亡，導致組織進一步損傷[11]。（2）炎癥反應：腦缺血后會觸發促進炎性因子如白細胞介素的釋放，激活小膠質細胞和外周白細胞，白細胞黏附至腦血管內皮細胞并釋放基質金屬蛋白酶和一氧化氮等，加劇神經元的死亡[12]。（3）谷氨酸的興奮毒性：腦缺血后，谷氨酸大量釋放，促進Ca2+、Na+大量內流，引起膜電位發生變化，導致神經元壞死[13]。

2 納米載藥系統用于缺血性腦卒中的藥效學研究

2.1 脂質體

在眾多納米載藥系統中，脂質體是研究最成熟的一種。脂質體是由磷脂和膽固醇以不同比例混合制得的親水親脂兩性分子的球狀囊泡：雙層結構使其能裝載親水性和疏水性藥物；類細胞膜結構使其不僅具有較低的毒性和較好的生物相容性，還易于進行表面修飾以實現靶向和緩釋的目的；而親脂性使其能通過內吞作用透過BBB入腦[14]。普通脂質體在體內會被機體網狀內皮系統（RES）快速清除，而經聚乙二醇（PEG）修飾的脂質體可有效躲避RES的識別，顯著提升其體內循環時間；再連接上轉鐵蛋白的抗體后，可靶向腦內皮細胞，從而成為優良的腦部給藥載體[15]。

缺血再灌注損傷主要是由于炎癥細胞的募集和激活引起的。為了抑制中性粒細胞的浸潤，Shimbo D等[16]采用脂質體載血紅蛋白（LEH）對大腦中動脈缺血（MCAO）模型大鼠進行動脈灌注給藥。結果顯示，LEH組大鼠腦梗死面積雖比對照組減少了15%，但只抑制了20%的中性粒細胞浸潤，且實驗結果并不能說明通過抑制中性粒細胞能減少腦梗死面積。

大部分神經保護劑由于副作用較大使其止步于臨床試驗。為了減少藥物用量并減少副作用，Ishii T等[17]將載有神經保護劑他克莫司的脂質體載藥系統作用于缺氧損傷的PC-12神經細胞，結果顯示其能夠將細胞存活率提高1倍；將其對模型小鼠尾靜脈給藥，和單純藥物相比，脂質體載藥系統能使小鼠腦組織中的粒細胞浸潤數減少一半；甚至給予僅載有1/3藥物劑量的脂質體載藥系統后，模型小鼠腦梗死面積也小于單純藥物組。該研究為其他神經保護劑的應用提供了新的思路。

促紅細胞生成素（EPO）是一種能促進紅細胞生成的糖蛋白，具有腦保護功效，但其過量使用會引起血栓并發癥；而唾液酸紅細胞生成素（A-EPO）是EPO的代謝物，不會引起上述副作用，但很難進入腦組織[18]。Ishii T等[19]用熒光染料DiI標記PEG修飾的脂質體并包載AEPO，對短暫性局灶性腦缺血模型大鼠給藥，24 h內解剖發現，大鼠腦缺血一側熒光標記的藥物濃度是非缺血一側的2～3倍；與給予單純包載A-EPO的脂質體相比，PEG修飾的載A-EPO脂質體對減少大鼠腦水腫和腦梗死面積的效果更顯著。

脂質體的載藥率高，少量脂質體所載藥物即可達到有效治療濃度；而且對脂質體進行轉鐵蛋白或其他靶向肽等表面修飾，還能顯著提高其入腦效率[20]。然而作為載藥系統，脂質體的穩定性和分散性較差，是其臨床轉化所面臨的主要障礙[21]。

2.2 納米粒

納米粒是指由天然或合成高分子材料組成的固態微粒，其中聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）、殼聚糖等是研究最廣泛的材料，也是良好的載藥系統。

2.2.1 PLGA納米粒 PLGA是美國FDA批準的藥物輔料，由乳酸和羥基乙酸兩種單體聚合而成，具有較高的包封率和良好的生物相容性，可以將藥物遞送到病灶部位以實現可控性釋放[22]。PLGA納米粒的制備方法主要有復乳溶劑蒸發法、納米粒沉淀法等。制備方法會影響其粒徑大小和包封率，其中采用復乳溶劑蒸發法所得納米粒的粒徑較小，且有較好的穩定性和生物相容性[23]。

超氧化物歧化酶（SOD）作為一種抗氧化酶，能清除ROS從而抑制細胞凋亡，但外源性SOD在體內半衰期短、無法透過BBB[24]。Reddy MK等[25]通過復乳溶劑蒸發法將SOD包裹于PLGA中，制備成粒徑約為80 nm的納米粒；與游離SOD和PEG修飾的SOD相比，PLGASOD納米粒在相同低劑量條件下，能使經過氧化氫處理的神經細胞存活率提高50%。有研究對模型大鼠分別經頸總動脈注射生理鹽水、SOD、PLGA和PLGA-SOD納米粒，結果顯示PLGA-SOD給藥組大鼠的腦梗死面積為25%，其他給藥組大鼠的腦梗死面積均超過50%；PLGA-SOD組大鼠28 d存活率達到了75%，而其他給藥組大鼠只有3 d存活時間[26]。除了清除ROS，有研究采用PLGA包載EPO來提高氧氣的遞送量從而減輕腦損傷，結果顯示，達到相同治療效果的載藥納米粒所需EPO劑量僅為單純EPO的1/16，說明PLGA載體能顯著提高EPO的入腦量[27]。

為了進一步提高載藥系統的靶向性，Mdzinarishvili A等[28]采用PLGA納米粒裝載神經保護劑甲狀腺激素，并以谷胱甘肽進行修飾，結果發現該納米粒能通過BBB上的谷胱甘肽轉運子實現高效入胞，從而使甲狀腺激素發揮促進新神經元發展分化的作用。然而，盡管PLGA納米載藥系統穩定性好，但其存在突釋問題，往往會使到達靶器官的藥物無法達到有效劑量[29]。

2.2.2 殼聚糖納米粒 除了PLGA之外，殼聚糖也常用于納米粒的制備。殼聚糖是從蝦殼中提取的多糖，具有生物可降解、穩定性高、毒性低等特點，可包載胰島素、疫苗和基因藥物等[30]。殼聚糖納米粒主要采用離子交聯法制備，通過三聚磷酸鈉與殼聚糖發生分子間或分子內交聯而制得[31]。Ahmad N等[32]采用該方法制備了包載抗氧化劑蘆丁的殼聚糖納米粒，其平均粒徑為92 nm，載藥率約為40%，能夠在體外長效釋放蘆丁達24 h；對缺血性腦卒中模型大鼠鼻腔給藥后發現，與單純蘆丁給藥相比，其能使大鼠腦梗死面積減少15%；然而該載藥系統也存在突釋問題，1 h內的藥物釋放量可約達30%。Verma SK等[33]采用聚山梨酯80修飾殼聚糖以透過BBB，并包載神經保護劑利魯唑，制備成粒徑約為50 nm的載藥納米粒；以該納米粒對模型小鼠進行腹腔注射，結果顯示其能顯著減少小鼠腦組織中環氧合酶2（COX-2）、一氧化氮合酶（NOS）的表達，并能減少神經元細胞的死亡。為進一步提高納米粒的入腦效率，Yemi?ci M等[34]對包載有天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）抑制劑的殼聚糖納米粒進行轉鐵蛋白修飾，使該納米粒能通過轉胞吞作用透過BBB，達到抑制Caspase-3激活、改善腦損傷的目的。

盡管殼聚糖作為載藥系統的緩釋性和靶向性都較好，然而其制備過程中引入的有機溶劑有潛在的生物毒性，而且其分散性較差[23]。若能進一步優化制備方法，將會有更大的應用價值。

2.3 納米凝膠

納米凝膠是一種粒徑在500 nm以內的水凝膠，水凝膠是一種能保持一定形狀、有三維網狀結構的高分子體系，該載藥體系能包載大量帶電荷分子，如小干擾RNA（siRNA）、DNA和小分子化合物[35]。相關研究表明，納米凝膠體系能增加寡聚核苷酸的入腦量，其機制涉及腦微血管內皮細胞的轉胞吞作用[24]。血管內皮生長因子（VEGF）是在缺血性腦卒中研究中應用最多的促血管生成因子，其能促進血管內皮細胞增殖和新生血管形成，但是體內半衰期短，且入腦困難。Emerich DF等[36]用凝膠載藥系統包載VEGF后，有效延長了其釋放時間；將包載VEGF的納米凝膠通過顱內注射到模型大鼠紋狀體，結果顯示其可減小大鼠腦梗死面積，而注射空白納米凝膠載體則未見類似效果。有研究采用納米凝膠對模型大鼠進行靜脈注射來遞送尿激酶，結果發現載藥納米凝膠能延長藥物在體內的循環時間，并能降低溶栓后的出血性風險[37]。

納米凝膠是良好的緩釋載藥系統，但其生物相容性還有待提高，因此設計多重響應性凝膠載藥系統并提高其靶向性成為了近年來的研究熱點[38]。

2.4 樹狀大分子膠束

樹狀大分子作為一類高度分支化、單分散的大環聚合物，具有良好的水溶性、可控的尺寸，內部擁有廣闊的載藥空間[39]。此外，其端基官能團具有較好的化學反應性，可與不同功能基團連接而實現多種功能，與疏水或親水基團結合后可形成單分子膠束[40]。與傳統膠束相比，樹枝狀大分子所形成的膠束體系具有更好的穩定性，能夠在體循環中有效運輸藥物，避免提前釋藥。聚酰胺-胺（PAMAM）樹枝狀大分子是目前應用最為廣泛的樹枝狀分子[41]。Kim ID等[42]采用PAMAM樹狀大分子作為載體遞送siRNA進入神經元，但轉染效率較低；對PAMAM樹狀大分子進行PEG修飾及肽靶向修飾后再包載siRNA，對模型小鼠進行尾靜脈注射，結果發現小鼠腦組織中大量表達該外源基因，表明樹狀大分子有望作為中樞神經系統基因治療的一種有效的非病毒載體。

樹狀大分子作為納米載藥系統也有潛在的生物毒性（如細胞毒性和血液毒性），因此限制了其在臨床的應用[43]，如何解決以上問題是將來的研究方向。

2.5 基于無機納米材料的載藥系統

無機納米材料在腫瘤的診斷和治療中已得到廣泛應用。碳納米管是由石墨片繞中心軸環繞而成的一個管狀物，進行功能修飾后能有效地遞送基因藥物。Costa PM等[44]對碳納米管進行氨基修飾后，對模型大鼠進行腦內定向給藥，通過組織電鏡觀察證實該碳納米管能被神經元細胞內吞；隨后以氨基修飾的碳納米管包載基因藥物，對模型大鼠進行腦內定向給藥后，發現大鼠腦皮質區域的細胞死亡數量顯著減少。該研究提示將基因藥物與新型載藥技術聯合，有望進一步提高藥物療效。然而碳納米管自身的毒性一直是其不足之處[45]，其在腦內的滯留時間和代謝方式都需要進一步觀察。

Kim CK等[46]針對氧化鈰納米顆粒固有的清除ROS的能力進行研究，發現粒徑為3 nm的氧化鈰納米顆粒只會進入模型大鼠的缺血側腦組織，并能減小一半腦梗死面積，而不會進入正常腦組織。盡管氧化鈰能較好地清除ROS，但其生物相容性問題限制了其在體內的應用[47]。

3 納米載藥系統在缺血性腦卒中成像中的應用

分子生物學的發展為納米載藥系統提供了豐富的靶向配體，顯著提升了納米載藥系統的親和性。研究者開發了多種集靶向、成像和治療于一體的多功能納米載藥系統，對于缺血性腦卒中的診斷和治療具有重要的應用價值。

為了追蹤干細胞在缺血性腦卒中模型大鼠體內的遷移情況，Hao L等[48]利用磁共振成像（MRI）的造影劑超順磁性氧化鐵（SPIO）納米顆粒對干細胞進行標記，再通過MRI對干細胞進行追蹤，然而結果發現，SPIO標記的干細胞組與SPIO組在MRI特征上并沒有明顯區別。由于外源納米顆粒主要會被巨噬細胞攝取，而缺血后的炎癥反應主要由腦中的小膠質細胞和血液循環中的巨噬細胞組成，因此SPIO也被用于缺血性腦卒中模型的炎癥成像[38]。膽堿作為天然存在的神經保護劑，其在MRI中有化學位移飽和轉移（CEST）信號，Liu H等[49]利用CEST-MRI技術發現，載膽堿的脂質體載藥系統主要集中于腦缺血一側并逐漸累積，這一技術有望應用于臨床試驗。

4 結語

盡管納米載藥系統在缺血性腦卒中領域的應用發展蓬勃，但是仍存在巨大的挑戰。首先，納米載藥系統的肝臟毒性、長期毒性等安全性研究相對缺乏制約了其發展。其次，納米載藥系統在體內透過BBB的分子機制尚不清楚，無法針對性地優化制備工藝、減少BBB對藥物的泵出。再次，關于神經系統給藥的靶點仍有待研究。此外，模型動物和臨床患者的發病機制不盡相同，且不同動物模型的病理學差異也會影響實驗結果，這也是納米載藥系統難以轉化為臨床應用的原因之一。

綜上，基于多種治療缺血性腦卒中的藥物因BBB的阻擋而使其臨床效果不佳，研究者們通過設計不同的納米載藥系統來遞送藥物，并獲得了一定成果。盡管不同納米載藥系統都有各自的優缺點，但是其在腦組織內的降解機制和滯留時間等研究都還不夠深入，大部分研究都處于實驗室階段，其臨床轉化是一個較大的挑戰。今后應更加關注納米藥物在體內以及腦內應用的效果及安全性。此外，考慮到缺血性腦卒中疾病的復雜性，載藥系統所裝載的藥物不應只考慮到對其病灶的治療，而應更多地考慮為神經系統提供綜合性的保護。

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