青果氯仿萃取部位的化學成分研究Δ

楊洛萍，孟涵，譚穗懿，陳金香，段文軍#（.南方醫科大學藥學院，廣州5055；.南方醫科大學中醫藥學院，廣州 5055）

青果為蕓香目橄欖科橄欖屬植物橄欖（Canarium albumRaeusch.）的成熟果實，主要有清肺、利咽、生津、解毒的功效[1]。2015年版《中國藥典》（一部）記載青果可治療咽喉腫痛、煩渴、咳嗽吐血、菌痢、癲癇，可解河豚毒及酒毒[2-3]，為我國常用的清熱、利咽的傳統中藥。其主要成分有多酚類、黃酮類、香豆素類、三萜類等[4-5]。本課題組前期試驗中發現青果氯仿萃取部位具有體外抗人類免疫缺陷病毒（HIV）活性[6-7]，為進一步探究其抗HIV活性的物質基礎，本研究對青果氯仿萃取部位的化學成分進行了系統分離鑒定，為明確青果抗HIV活性成分及探索抗艾滋病藥物的先導化合物提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

Bruker AVANCEⅢ400型核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；LC-16型液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；ZQ4000型液相色譜-質譜儀（美國Waters公司）；1290型超高效液相色譜-6230型飛行時間質譜儀（美國Agilent公司）。

1.2 試劑

聚酰胺填料（300～400目，上海江萊生物科技有限公司）；柱層析硅膠（200～300目，青島海洋化工海洋公司）；小孔吸附樹脂（MCI，75～150 μm，日本Mitubishi Chemical公司）；FUJI反相C18硅膠填料[40～75 μm，賽譜銳思（北京）科技有限公司]；Sephadex LH-20凝膠樹脂（美國GE Healthcare公司）；Toyopearl HW-40F凝膠樹脂（日本Tosoh公司）；薄層色譜硅膠板（青島海洋化工廠）。

1.3 藥材

青果購于廣東省潮州市潮安縣文祠鎮下赤村果園，由南方醫科大學中醫藥學院劉強教授鑒定為橄欖的成熟果實。

2 方法與結果

2.1 提取與分離

取青果50 kg，洗凈后于65℃烘箱中干燥8 h，剝離果核后繼續在55℃烘箱中干燥，得干燥的青果果肉4 kg。干燥果肉粉碎后用75%乙醇溶液回流提取3次，每次1.5 h，合并濾液后減壓濃縮，得浸膏。浸膏用水分散，依次以氯仿、乙酸乙酯各萃取3～4次，水相與有機相體積比均為1∶1。回收有機溶劑，得氯仿萃取部位108 g，乙酸乙酯萃取部位86 g。將氯仿萃取部位加乙醇溶解，經聚酰胺層析柱，以乙醇-水（0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，V/V）梯度洗脫，經薄層色譜鑒別，富集濃縮，得4個流分（Fr.1～Fr.4）。

流分Fr.1（19 g）經MCI柱，以甲醇-水（0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，V/V）梯度洗脫，得流分Fr.1-1～Fr.1-9。其中，Fr.1-4經Toyopearl HW-40F凝膠樹脂柱與反相C18柱，以甲醇-水（0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶8、5∶5，V/V）梯度洗脫，經薄層色譜鑒別，富集濃縮，得化合物1（16 mg）和化合物2（3 mg）。

流分Fr.2（3.6 g）經MCI柱，以甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0，V/V）梯度洗脫，得流分Fr.2-1～Fr.2-10。將Fr.2-1、Fr.2-2經薄層色譜富集、濃縮、合并，經Sephadex LH-20凝膠樹脂柱與Toyopearl HW-40F凝膠樹脂柱，以甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7，V/V）梯度洗脫，經薄層色譜鑒別，富集濃縮，得化合物3（399 mg）。

流分Fr.3（4.4 g）經MCI柱，以甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，V/V）梯度洗脫，得流分Fr.3-1～Fr.3-10。將Fr.3-1～Fr.3-3經薄層色譜富集、濃縮、合并，經Sephadex LH-20凝膠樹脂柱，以甲醇-水（7∶3，V/V）等度洗脫，得化合物4（98 mg）；Fr.3-6經反相C18柱與Sephadex LH-20凝膠樹脂柱，以甲醇-水（2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，V/V）梯度洗脫，得化合物5（12 mg）和化合物6（8 mg）。

流分Fr.4（5.2 g）經MCI柱，以甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0，V/V）梯度洗脫，得流分Fr.4-1～Fr.4-10。將Fr.4-3～Fr.4-5經薄層色譜富集、濃縮、合并，經反相C18柱，以甲醇-水（5∶5，V/V）等度洗脫，得化合物7（13 mg）；Fr.4-7經Sephadex LH-20凝膠樹脂柱與反相C18柱，以甲醇-水（2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，V/V）梯度洗脫，得化合物8（305 mg）。

2.2 結構鑒定

化合物1：棕色粉末，易溶于水；紫外-可見光譜最大吸收波長（UVλmax）：266 nm；電噴霧電離質譜（ESI-MS）：質荷比（m/z）443[M-H]-；分子式：C21H32O10，分子量：444。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ：7.66（1H，d，J＝16.0 Hz，H-4），6.44（1H，d，J＝16.0 Hz，H-5），5.77（1H，s，H-2），4.47（1H，d，J＝8 Hz，Glc H-1），4.22（1H，m，H-3′），3.85、3.66（2H，m，Glc H-6），3.80（1H，m，Glc H-2），3.38（1H，m，H-7′），3.38（1H，m，Glc H-3），3.29（1H，m，Glc H-4），3.13（1H，m，Glc H-5），2.16、1.96（2H，m，H-4′），2.01（3H，s，CH3-6），1.77（2H，m，H-2′），1.11（3H，s，CH3-9′），0.87（3H，s，CH3-10′）。13C-NMR（100 MHz，D2O）δ：170.28（C-1），151.27（C-3），133.12（C-5），130.54（C-4），117.72（C-2），101.07（Glc C-1），86.67（C-5′），82.47（C-8′），75.83（Glc C-3），75.71（C-7′），75.39（Glc C-2），73.48（C-3′），73.04（Glc C-5），69.54（Glc C-4），60.63（Glc C-6），47.79（C-1′），40.74（C-4′），40.57（C-2′），20.15（C-6），18.32（C-9′），14.98（C-10′）。與文獻[8]的波譜數據基本一致，故可確定該化合物為二氫紅花菜豆酸3′-O-β-D-葡萄糖苷（Dihydrophaseic acid-3′-O-β-D-glucopyranoside）。

化合物2：淡黃色粉末，易溶于水；FeCl3反應顯藍紫色；UVλmax：212、258、293 nm；ESI-MS：m/z153[M-H]-；分子式：C7H6O4，分子量：154。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ：7.34（1H，d，J＝8.2 Hz，H-6），7.32（1H，s，H-2），6.80（1H，d，J＝8.2 Hz，H-5）。13C-NMR（100 MHz，D2O）δ：170.14（COOH），149.35（C-4），143.49（C-3），123.57（C-1），121.53（C-6），116.98（C-2），115.38（C-5）。與文獻[9]的波譜數據基本一致，故可確定該化合物為3，4-二羥基苯甲酸（3，4-dihydroxybenzoic acid）。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇；FeCl3反應顯藍紫色；UVλmax：215、273 nm；高分辨飛行時間質譜（HR-TOFMS）：m/z345.082 8[M+H]+，343.047 6[M-H]-；分子式：C14H16O10，分子量：344。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.08（2H，s，Galloyl H），5.40（1H，m，H-3），4.21（1H，m，H-5），3.80（1H，dd，J＝7.9，2.9 Hz，H-4），2.24（2H，m，H-2），2.17（1H，m，H-6a），2.06（1H，dd，J＝13.8，6.0 Hz，H-6b）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：177.01（COOH），167.79（COO），146.39（C-3′，C-5′），139.80（C-4′），121.62（C-1′），110.24（C-2′，C-6′），75.88（C-1），73.10（C-3），72.26（C-4），70.94（C-5），38.34（C-2），38.10（C-6）。與文獻[10]的波譜數據基本一致，故可確定該化合物為3-O-沒食子酰奎尼酸（3-O-galloyl quinic acid）。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇；UVλmax：212、268 nm；ESI-MS：m/z169[M-H]-；分子式：C7H6O5，分子量：170。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.08（2H，s，H-2，H-6）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：168.98（COOH），144.93（C-3，C-5），138.12（C-4），120.57（C-1），108.88（C-2，C-6）。與文獻[11]的波譜數據基本一致，故可確定該化合物為沒食子酸（Gallic acid）。

化合物5：黃色粉末，易溶于甲醇；FeCl3反應顯藍紫色；UVλmax：214、272 nm；ESI-MS：m/z197[M-H]-；分子式：C9H10O5，分子量：198。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.05（2H，s，H-2，H-6），4.29（2H，q，J＝7.1 Hz，OCH2），1.36（3H，t，J＝7.1 Hz，CH3）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：167.08（C＝O），145.01（C-3，5），138.21（C-4），120.31（C-1），108.53（C-2，6），60.19（OCH2），13.17（CH3）。與文獻[12]的波譜數據基本一致，故可確定該化合物為沒食子酸乙酯（Ethyl gallate）。

化合物6：黃色晶體，易溶于甲醇；紫外燈下顯藍色熒光；ESI-MSm/z：215[M+Na]+；分子式：C10H8O4，分子量：192。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.86（1H，d，J＝9.4 Hz，H-4），7.12（1H，s，H-8），6.78（1H，s，H-5），6.22（1H，d，J＝9.4 Hz，H-3），3.92（3H，s，OCH3）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：162.58（C-2），151.45（C-7），149.95（C-9），145.61（C-6），144.64（C-4），111.14（C-3），111.08（C-10），108.47（C-5），102.49（C-8），55.34（OCH3）。與文獻[13]的波譜數據基本一致，故可確定該化合物為東莨菪內酯（Scopoletin）。

化合物7：黃色結晶粉末，難溶于水、甲醇、氯仿；Fe-Cl3反應顯藍紫色；UVλmax：251、360 nm；HR-TOF-MSm/z：449.071 3[M+H]+，447.056 1[M-H]-；分子式：C20H16O12，分子量：448。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.74（1H，s，H-5），7.45（1H，s，H-5′），5.46（1H，s，Rha H-1），4.01（1H，m，Rha H-2），3.85（1H，dd，J＝9.4，3.4 Hz，Rha H-3），3.55（1H，m，Rha H-5），3.33（1H，t，J＝ 9.4 Hz，Rha H-4），1.14（3H，d，J＝6.2 Hz，Rha H-6）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：159.51（C-7），159.36（C-7′），149.14（C-4′），146.78（C-4），141.71（C-3），140.27（C-3′），137.09（C-2′），136.81（C-2），114.91（C-6），112.09（C-6′），111.98（C-5），110.68（C-5′），108.34（C-1），107.77（C-1′），100.58（Rha C-1），72.19（Rha C-4），70.49（Rha C-3），70.34（Rha C-5），70.29（Rha C-2），18.28（Rha C-6）。與文獻[14]的波譜數據基本一致，故可確定該化合物為鞣花酸-4-O-α-L-吡喃鼠李糖苷（Ellagic acid-4-O-α-L-rhamnopyranoside）。

化合物8：淡黃色粉末，易溶于甲醇、丙酮；UVλmax：198、218、268 nm；HR-TOF-MSm/z：657.067 7[M+Na]+，633.038 7[M-H]-；分子式：C27H22O18，分子量：634。1HNMR（400 MHz，Acetone-d6）δ：7.14（1H，s，Gal H-2，6），6.85（1H，s，HHDP H-2），6.71（1H，s，HHDP H-2′），6.39（1H，d，J＝ 2.0 Hz，Glc H-1），4.97（1H，t，J＝10.9 Hz，Glc H-6a），4.84（1H，m，Glc H-3），4.53（1H，m，Glc H-5），4.47（1H，m，Glc H-4），4.12（1H，dd，J＝11，8.1 Hz，Glc H-6b），4.08（1H，d，J＝1.3 Hz，Glc H-2）。13C-NMR（100 MHz，Acetone-d6）δ：167.71（HHDP C′＝O），166.29（HHDP C＝O），164.25（Gal C＝O），144.96（Gal C-3，5），144.47（HHDP C-3，5），143.87（HHPP C3′），143.99（HHDP C5′），138.40（Gal C-4），136.28（HHDP C-4′），135.78（HHDP C-4），124.62（HHPP C-1），124.78（HHDP C-1′），119.85（Gal C-1），115.62（HHDP C-6′），114.96（HHDP C-6），109.87（Gal C-2，6），109.01（HHDP C-2），107.13（HHDP C-2′），93.26（Glc C-1），74.71（Glc C-5），69.74（Glc C-3），68.04（Glc C-2），63.42（Glc C-4），61.31（Glc C-6）。與文獻[15]的波譜數據基本一致，故可確定該化合物為異柯里拉京（Isocorilagin）。

3 討論

本研究首次青果氯仿提取部位的化學成分進行分離鑒定，共分離得到化合物1～8，分別為二氫紅花菜豆酸3′-O-β-D-葡萄糖苷、3，4-二羥基苯甲酸、3-O-沒食子酰奎尼酸、沒食子酸、沒食子酸乙酯、東莨菪內酯、鞣花酸-4-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、異柯里拉京。其中，化合物1、2、7為首次從青果中分離得到，而化合物8已由本課題組研究證實具有抗HIV的作用（行文待發）。據文獻[16]報道，從苦味葉下珠（Phyllanthus amarus）的葉中分離的柯里拉京可以較強地抑制HIV在MT-4細胞中的復制，而從麻瘋樹（Jatropha curcas）和紫斑大戟（Chamaesyce hyssopifolia）中分離得到的柯里拉京可以體外抑制HIV逆轉錄酶[17]。本課題組分離到的異柯里拉京與柯里拉京結構上的差別只在于葡萄糖端基與沒食子酸形成的苷鍵分別在β位與α位，故其可能具有抗HIV活性，但具體的抗病毒機制尚需深入研究。

[1] 國家中醫藥管理局.中華本草[M].上海：上海科學技術出版社，1999：21.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：197.

[3] 南京中醫藥大學.中藥大辭典[M].2版.上海：上海科學技術出版社，2006：3667.

[4] 常強，蘇明華，陳清西.橄欖化學成分與藥理活性研究進展[J].熱帶作物學報，2013，34（8）：1610-1616.

[5] HE Z，XIA W，JIE C.Isolation and structure elucidation of phenolic compounds in Chinese olive（Canarium album L.）fruit[J].Eur Food Res Technol，2008，226（5）：1191-1196.

[6] 楊潔，孫魏，楊旭銳，等.青果抗人免疫缺陷病毒活性部位的篩選研究[J].中國藥房，2008，19（21）：1603-1605.

[7] 譚穗懿，段恒，梁錚林，等.青果氯仿提取組分體外抗人類免疫缺陷病毒活性及其作用機制[J].中國醫院藥學雜志，2014，34（15）：1247-1251.

[8] 萬國盛，任宇豪，高慧媛，等.文冠果果殼化學成分的分離與鑒定[J].沈陽藥科大學學報，2015，32（1）：18-21.

[9] NGUYEN DM，SEO DJ，KIM KY，et al.Nematicidal activity of 3，4-dihydroxybenzoic acid purified from Terminalia nigrovenulosa bark against Meloidogyne incognita[J].Microb Pathog，2013，60（3）：52-59.

[10] NISHIMURA H，NONAKA GI，NISHIOKA I.Seven quinic acid gallates from Quercus stenophylla[J].Phytochemistry，1984，23（11）：2621-2623.

[11] LUO W，ZHAO M，YANG B，et al.Identification of bioactive compounds in Phyllenthus emblica L.fruit and their free radical scavenging activities[J].Food Chem，2009，114（2）：499-504.

[12] ATSUSHI O，SYUNTARO H，SHINJI K，et al.Identification and activity of ethyl gallate as an antimicrobial compound produced by Geranium carolinianum[J].Weed Biol Manag，2009，9（2）：169-172.

[13] 喻蓉，許慶，李伯剛，等.搭棚藤的化學成分研究[J].天然產物的研究與開發，2003，15（5）：405-407.

[14] YANG SW，ZHOU BN，WISSE JH，et al.Three new ellagic acid derivatives from the bark of Eschweilera coriacea from the Suriname rainforest[J].J Nat Prod，1998，61（7）：901-906.

[15] LIU X，CUI C，ZHAO M，et al.Identification of phenolics in the fruit of emblica（Phyllanthus emblica L.）and their antioxidant activities[J].Food Chem，2008，109（4）：909-915.

[16] NOTKA F，MEIER GR，Wagner R.Inhibition of wildtype human immunodeficiency virus and reverse transcriptase inhibitor-resistant variants by Phyllanthus amarus[J].Antiviral Res，2003，58（2）：175-186.

[17] MATSUSE IT，LIM YA，HATTORI M，et al.A search for anti-viral properties in Panamanian medicinal plants：the effects on HIV and its essential enzymes[J].J Ethnopharmacol，1999，64（1）：15-22.