食源性致病菌檢測技術研究進展

（南京市畜牧獸醫站，江蘇南京 210012）

食源性疾病的預防與控制已引起了世界各國關注。食源性疾病病原的檢測技術是食源性疾病的預防與控制的關鍵的技術環節。大腸桿菌、沙門氏菌等細菌是常見污染食品的致病菌。目前這些食源性致病菌是我國進出口食品的主要檢測項目。微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據之一。國家標準中的方法固然是最穩定最成熟的方法，但因其復雜費時，有時不能適應公共衛生事件應急處理快速反應的需要。隨著時代的進步，檢測方法的先進性、靈敏度、特異性要求都更高。特別是一些新的病原菌食源性疾病的發生，對檢測技術提出更高的要求。為此，人們在傳統的鑒定方法的基礎上，不斷地嘗試研制和改進檢測設備，研究和創新檢測技術，以求快速準確地檢測食品中的微生物含量。隨著分子生物學檢測技術的發展，為微生物快速檢測提供了良好的技術平臺。現結合標準的食源性病原菌的檢測方法，對食源性致病菌最新檢測技術及其研究進展進行簡述。

1 國內外食源性致病菌檢測現狀

目前已有許多國內和國際組織可以對食品檢測方法進行認證。在美國，主要機構是 AOAC（美國官方分析化學師協會），通過 AOAC 認證的方法一般都被視為是“權威或標準”的方法。國內食品微生物檢測主要執行標準通常采用國標中的檢測方法流程，并有相應的規定，菌落總數（包括霉菌酵母菌）和大腸菌群限量標準只規定最大限量，致病菌規定“不得檢出”。隨著食品等工業和醫學診斷等對微生物的控制和檢驗要求越來越嚴格，近年來也出現了不少快速檢測的方法及相應的自動化儀器。

2 食源性致病菌檢測方法簡介

2.1 傳統的微生物學檢測方法

主要是按照現行國標的標準方法檢測，最傳統，最經典，但步驟煩瑣，最麻煩，檢測周期較長，但是可作為其他方法的驗證。

2.2 顯色培養基方法

在培養基中分別加入某種特定的無色合成底物，經微生物特異性酶的作用而釋放出色原，呈各種顏色或熒光。大多數顯色培養基只需在樣品增菌后，分離培養18～24h，即可根據菌落的顏色做出初步的鑒定。結果直觀，一目了然。靈敏度高、特異性強，大大減少了后續的鑒定步驟。但存在一定的假陽性和假陰性，比如97%的大腸埃希氏菌含有β-葡萄糖苷酶，約10%的沙門氏菌屬中也含有此酶；不是所有具有特征性酶的微生物均在含底物的培養基中顯示陽性反應。

2.3 免疫膠體金技術

是以膠體金作為標記物結合免疫原理的一種應用于抗原抗體的新型技術，該技術運用最廣泛的就是斑點免疫金滲濾法（DIGFA）。鄢雷娜等[1]都利用此技術對沙門氏菌的快速檢測進行了研究，利用斑點免疫金滲濾法對沙門氏菌抗原進行了研究，結果表明此法簡單、快速，適合推廣運用；通過建立直接檢測沙門氏菌的斑點免疫金滲濾法檢測試紙盒對該菌進行了研究。

2.4 酶聯免疫吸附技術

簡稱 ELISA技術，此技術敏感性高，不需特殊設備，結果觀察簡便。它是把抗原抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用有機結合的一種檢測技術，既可以測抗原，也可以測抗體。早在1977年就有報道將酶聯免疫吸附法用于食品中沙門氏菌的檢測[2]，設計捕獲抗體和檢測抗體，建立快速檢測沙門氏菌雙抗夾心ELISA方法對食品中的沙門氏菌進行檢測。建立雙抗夾心ELISA體系，檢測模擬污染肉樣中沙門氏菌，其檢測限為800CFU/g，結果顯示與其他血清型沙門氏菌、單增李斯特菌等菌均無交叉反應，特異性良好。

2.5 分子生物學檢測方法

PCR技術是一項敏感性高、特異性強且快速準確的微生物檢測技術，也被許多學者用于對食源性致病菌的檢測和研究。邱楊等[3]采用傳統培養方法、BAX（r）方法和PCR 方法 3 種方法對沙門氏菌進行檢測。在常規PCR的基礎上建立了檢測沙門氏菌的新的PCR方法—多重PCR。此外其他新的PCR技術也運用于沙門氏菌的檢測，通過對熒光定量PCR反應體系和反應條件的摸索，建立了檢測沙門氏菌的核酸熒光定量PCR方法，此研究為沙門氏菌快速檢測試劑盒的研制打下了良好的基礎。

2.6 磁性納米材料檢測技術

主要是經過生物學修飾和功能化的磁性納米材料，特異性地識別基質中少量的致病菌，并通過磁場對靶細菌進行快速及高特異性的選擇性分離，實現樣品中少量致病菌的特異性分離富集，達到后續分析檢測的純度和數量。

2.7 核酸探針技術

一種利用探針編碼檢測食源性致病菌的方法，它是通過單一反應對多個食源性致病菌進行鑒定的實時PCR方法。是根據核苷酸堿基互補的原理，在已變異的DNA樣品中加入用同位素等標記的DNA特異片段，在一定條件下兩片段進行雜交從而達到檢測DNA的目的。在四色實時PCR儀上可實現對15種模板的基因分型的食源性致病菌的檢測方法。將培養后的菌株標本提取DNA；通用引物的設計及PCR產物的測序；設計熒光雙鏈置換探針；設計多色探針編碼體系；變溫雜交反應；構建單重實時PCR體系；構建多重多色實時PCR體系；驗證多重多色實時PCR體系。此技術不僅簡便、快速而且敏感性高、特異性強，已用于食品中沙門氏菌的檢測。李少彤等[4]通過建立一種新穎的肽核酸探針結合熒光原位雜交方法對血液、糞便、水以及嬰兒奶粉樣品中沙門氏菌進行了檢測，準確度高達 100%。

2.8 ATP生物熒光法

所有的生物體中都含有能夠傳達能量的ATP，檢驗ATP就可知道細菌數量及活性。微生物中含ATP量很少，如在熒光素酶、熒光物質與氧及鎂離子存在的條件下，其光量與樣品中ATP量成正比，憑此光量來檢驗微生物含量。

2.9 乳膠凝集（LA）技術

是一種最簡單的抗體檢測方法。在乳膠凝集實驗中，采用包被有抗體的彩色乳膠顆粒當與目標菌菌懸液混合后，如果懸液中有特異性抗原存在，就可以形成肉眼可見的凝集或沉淀。凝集反應簡便迅速，但靈敏度不高，反應約需要107CFU。即便如此，它的靈敏度也比傳統的血凝或細胞凝集試驗提高了10～100倍[5]。

2.10 噬菌體裂解技術

噬菌體有特異性裂解細菌的作用。利用此技術進行沙門氏菌快速檢測，李萌等[6]利用噬菌體裂解對150份樣品進行快速檢測，結果說明腸桿菌科噬菌體組合對培養10h的沙門氏菌敏感性和特異性較高，這對實現沙門氏菌實時、快速而準確的檢測有重要意義。

2.11 生物傳感器技術

生物傳感器是一種小型、便攜的分析裝置，由固定化并具有化學分子識別功能的生物材料、換能器件及信號放大裝置構成。其工作原理是待測物質與生物活性材料發生生物學反應，產生的信號由換能器轉換成可定量和可處理的電信號，經二次儀表放大輸出，最終獲得待測物濃度的信息。生物傳感器按識別元件可分為酶傳感器、微生物傳感器、組織傳感器、細胞器傳感器、免疫傳感器等。DNA生物傳感器的識別元件為核酸探針，因其便于與PCR技術結合而逐漸成為研發熱點。生物傳感器技術具有靈敏度高、特異性好、樣品前處理簡單、響應和檢測迅速、操作簡單、攜帶方便、可重復利用等優點。

3 小結

綜上所述，食源性致病菌檢驗技術正從傳統的培養方法向分子檢測方法改進，并向儀器化、標準化、自動化方向發展。隨著微生物檢測技術的日漸成熟，目前形成了集傳統檢測方法，快速檢測方法，以及大型儀器檢測于一體的檢測體系。伴隨著人們對食品安全以及人類健康等生活環境要求越來越高，在未來發展過程中需要我們不斷改進和創新，建立更成熟可靠、方便快捷的食源性致病菌快速檢測技術。

[1]鄢雷娜，羅躍華，劉緒平，等.乳制品中常見食源性致病菌檢測技術的研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2017，8（1）：138-141.