獸用疫苗生產過程中正確檢測和預防支原體污染的方法

余彬輝 余艷輝 賈布拖

（1.浙江易健生物制品有限公司，浙江紹興 311800；2.杭州佑本生物制品有限公司，浙江杭州 310018）

隨著我國獸醫專業的不斷發展，對于動物疾病的診斷技術水平也不斷地提高，相關領域的技術人員對于支原體的認識也更加的深入，現在所知的自然界中存在的這類微生物已經遠遠超過了100種，根據國內外現有的報道可知這100余種的微生物都會通過直接或間接的方式對人類和動物造成疾病的感染。如果人或者動物感染支原體，會造成呼吸道出現感染、生長發育停滯并且會對免疫系統造成相應的損傷。此外，通過細胞培養生產生物制品也面臨著比較難解決的情況，所以相關的獸醫工作者對此給予了比較廣泛的關注。

1 相關概述

支原體屬于原核微生物，不具有細胞壁，個體微小，呈高度多態性，一般是通過常用的濾菌器，其毒株主要通過特殊的結構黏附于宿主細胞膜上，并與相應的受體結合，引起宿主細胞膜結構的改變及誘導宿主細胞產生某些細胞因子，從而導致宿主細胞的免疫反應表現出異常，最終可以引起各種疾病的發生。根據相關的試驗結果可知：國內采用的普通疫苗和細胞生產活毒疫苗被支原體造成了比較嚴重的污染，這樣對生物制藥企業造成非常大的經濟壓力，同時也不利于畜禽疾病防恐工作的順利開展。相關規定中注明所有細胞生產的活疫苗并不能檢測到支原體的污染情況，所以就要求相關的技術人員掌握一定的對于支原體的檢測技術，以保證生物制品生產工作得以比較順利的開展和發展。

2 支原體的檢測

2.1 傳統檢測法

直接培養法：我國的相關準則中明確規定，直接培養法是支原體檢測的標準方法。具體主要是將待檢樣品接種到支原體培養基上，對液體培養基的顏色和固體培養基上支原體菌落的變化進行觀察，然后通過正確的判斷給出試驗結果，這種方法的準確率比較高但是培養的時間卻比較長，同一個培養基中所有的支原體類型并不能全部的檢測出來，所以這種檢測方法一般應用于種毒和成品的檢測方面。

DNA熒光染色法：此種方法也被稱為指示細胞法，此種檢測方法的耗時比較短，并且能夠同時對于多個樣品進行檢測，并且對于采用培養法不能檢測出的支原體給予正確的檢測，如果有條件在配制疫苗之前就進行初步的檢測，將其中不合格的樣品去除掉，這樣能夠避免相應的損失并且對疫苗的質量加以有效的保證。

2.2 血清學法

被動顆粒凝集試驗（PPA）：可應用于細菌、支原體的鑒定和抗體的定性檢測。我國相關的專家用此方式對肺炎支原體進行檢測，結果可知被動凝集法的操作比較簡單，但是卻具有比較高的精確性和敏感度，在實際的臨床生產中可以更有效的應用。

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）：醫學界至今為止，用此種方法是診斷人和動物肺炎支原體實用和可靠的方法之一。本檢測方法操作簡單并且特異性和敏感性都比較佳，目前已經被廣泛應用于臨床獸醫學領域，并且成為檢測肺炎支原體的在臨床中的常規方法。

2.3 分子生物學技術

PCR檢測技術：支原體通常生長都比較緩慢并且對于營養環境的要求相對比較高，并且在種間存在交叉抗原等生物學特性。隨著相關領域研究人員逐漸深入對支原體的核酸結構、分子組成及其特異性的了解，國際上就已經在支原體的檢測中融入了PCR技術，在特異性和靈敏性方面有更佳的表現，并且在獸用生物制品的生產中進行了廣泛的推廣和應用，但是此種方法對于試驗環境和儀器的要求標準相對比較高，所以很容易出現交叉污染的情況，生產中必須給予足夠的重視。

巢式PCR檢測法：基于PCR檢測方法加以優化改進，主要是通過設計巢式PCR引物的方式，根據擴增后是否存在目的片段的情況對具體的污染狀況加以比較合理且正確的判斷，然后根據存在片段的大小情況，對于污染的支原體類型進行正確的判斷分析，從而將污染源進行準確的判斷。

實時熒光定量PCR技術：根據相關的報道可知，最初是早在1996年的美國某家公司第一次推出了實時熒光定量PCR檢測技術。現在，在動物營養與繁殖、動物遺傳育種及動物疾病檢測和預防等領域已經都有了實時熒光定量PCR技術的應用，但在實際應用中，在應用方面沒有達到特別廣泛的范圍，從而受到了一定的限制，所以在實際的生產應用時應該給予一定的重視。

DNA分子雜交檢查法：原核生物的rRNA是高度保守的。采用這種檢測方法具有特異性高的特點，可大致的鑒別出污染支原體的種類。

3 相關防治措施

就目前所知的情況，自然界中有多于120種的支原體存在，實際在生物制品的生產過程中，感染支原體的組織細胞中會在不同程度上改變細胞形態和遺傳物質，從而對病毒的復制過程產生一定的影響，同時會在不同程度上改變宿主細胞的免疫能力，從而誘導干擾素的產生。所以在獸用疫苗生產過程中，尤其是將培養細胞作為材料的疫苗生產情況，應該對于支原體的防治加以重視，決不能忽視。對于支原體的污染進行糾正的時候應該保持細胞營養液呈酸性，這樣對于抑制支原體的生長是比較有效的條件。目前我國從事獸用疫苗生產研究的技術人員在參與生產生物制品的研制生產過程當中，以檢測支原體的存在，以及鑒定支原體的種類是該手段實施的主要目的，也就是生產中所說的檢測細胞的污染源，從而力爭將其切斷，最后才可以對污染細胞的相關來源采取比較有效的防治手段進行干涉，減少甚至是控制細胞的污染情況。