茶炭疽病拮抗放線菌的分離篩選與鑒定

劉紅艷，李 維，向 芬，周 琳，丁 玎，曾 振，周凌云

（湖南省農業科學院 茶葉研究所，湖南 長沙 410125）

茶炭疽病（Gloeosporium theae sinesisMiyake）是我國茶園一種重要真菌病害，該病在全國各茶區普遍發生，主要危害茶樹的葉部，一般從幼齡葉片背部的毛孔侵入，經8～15 d潛伏期后開始形成病斑，遇到溫暖濕潤時易造成該病大面積的爆發流行，茶葉產量和品質下降，造成嚴重的經濟損失，嚴重阻礙茶產業的發展[1-2]。目前茶炭疽病的防治除農業防治外，主要依靠化學藥劑，造成環境污染和農殘一系列的問題，這些問題已經引起國內外有關專家的高度關注[3-4]。因此加快新型農藥研制與采用拮抗微生物來防治茶樹炭疽病非常必要。

放線菌是具有巨大實用價值的一類微生物，是抗生素的主要生產菌，是新農藥和生物防治活菌劑研制的主要源頭[5]。利用放線菌的次生代謝產物——抗生素制備的生物農藥，由于其具有無污染、無殘留、可再生、難以使有害生物產生抗藥性、易于產業化、成本低等特點，目前已成為無公害農藥的主體和未來農藥的發展方向[6]。通過分離篩選與利用拮抗放線菌達到環保、高效的生物防治目的已經成為當前農業科學研究熱點之一[7]。本試驗從湖南茶園采集的土樣中分離篩選的放線菌F2菌株，具有拮抗茶炭疽病的活性，能顯著抑制炭疽病菌的生長。結合形態、培養特征、16S rDNA等對其進行了分類鑒定，旨在為進一步防治茶炭疽病提供生防材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

采自湖南省茶葉研究所長沙高橋試驗基地、湘陰縣蘭嶺茶場、長沙縣金井茶場有機茶園與常規茶園不同肥力茶園。根據采樣地點的地形，采用對角線法5點取土樣，每個點取土樣量大體一致，取樣深度為0～20 cm，均勻混合后將其裝入滅菌封口聚乙烯袋，4℃低溫保存，待分離。

1.1.2 供試菌株

供試病原菌茶炭疽病菌（Gloeosporium theae sinesisMiyake）由本所植保實驗室分離、鑒定和保存。

1.1.3 供試培養基

分離與保存用培養基：高氏合成一號培養基；拮抗試驗用培養基：PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基）。

1.2 方法

1.2.1 土壤放線菌的分離、培養

采用稀釋涂布平板法[8]進行放線菌的分離。稱取采集的土壤樣品10 g，放入裝有90 mL無菌水的300 mL玻璃三角瓶中振蕩，制得10-1的稀釋液，靜置1 min后用無菌移液管吸取1 mL的上清液，加入已裝有9 mL無菌水的試管中混勻，制得10-2的稀釋液，依次制備10-3～10-6稀釋液。用無菌移液管吸取稀釋液0.1 mL，分別滴加到含有3‰抑菌劑（K2Cr2O7）的高氏合成一號培養基平板上，用無菌玻璃刮刀涂勻，靜置30 min后，置于28℃恒溫培養箱內倒置培養5～7 d，觀察放線菌的出現情況，并將其中的放線菌單菌落挑出，純化培養，純化好的菌種轉入斜面，4℃條件下冰箱保存備用。采用平板對峙法[5]判斷菌株對病原真菌的作用。

1.2.2 茶炭疽病拮抗菌的篩選

采用平板對峙法進行抑菌試驗。將病原真菌茶炭疽病菌在PDA培養基上培養5 d，將分離純化好的各種放線菌在高氏合成一號培養基上涂皿繁殖7 d，用滅菌打孔器（d＝5 mm）將放線菌打成圓形的菌餅，并將放線菌菌餅接種于PDA平板的邊緣，呈對等的三角形，置28℃下恒溫培養，待其定殖后將在PDA平板上培養繁殖5 d的1塊直徑為5 mm的茶炭疽病菌菌餅，接種于PDA平板的中央，并設空白對照。靜置1 h后再放入28℃恒溫培養箱中培養，每處理重復3皿，適時檢查其菌落周圍有無抑菌圈，待對照菌落長滿整個培養皿后，測量抑菌圈的直徑。

1.2.3 拮抗菌株F2的分類鑒定

形態培養特征觀察[8]：肉眼觀察劃線接種在高氏合成一號瓊脂培養基、PDA、酵母精麥芽糖精瓊脂培養基（ISP4）平板上，于28℃培養的培養特征；使用高氏合成一號培養基和插片法接種，28 ℃下培養，分別于 7 d、15 d、30 d 將蓋玻片取出，在顯微鏡下觀察其菌絲、孢子的形態特征，即分別在 7 d、15 d、30 d 觀察記錄其菌絲、孢子和可溶性色素的顏色變化，以成熟期的顏色作為其定種依據，顯微觀察并照相。

16S rDNA的PCR擴增：參照Nikodinovic等[9]和Kauffmann等[10]的方法提取放線菌基因組DNA，采用細菌通用引物：27F 5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,1492R 5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，以基因組DNA為模板，PCR的擴增：25 μL 反應體系94℃預變性 10 min，94℃變性 1 min，55℃復性 1 min，72℃延伸 1 min，32 個循環，72 ℃延伸 10 min。采用 1.0%的瓊脂糖對PCR 擴增產物進行電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 放線菌的分離篩選及拮抗活性測定

以茶炭疽病菌（Gloeosporium theae sinesisMiyake）為供試病原菌，從湖南茶園土壤中篩選得到了258個放線菌菌落，篩選出6株具有較好拮抗作用的菌株并編號，其中以F2菌株的抑菌效果最好，通過拮抗性初步測定，對茶炭疽病菌的抑菌圈直徑達44 mm。

2.2 放線菌F2菌株的分類鑒定

2.2.1 F2菌株的形態培養特征

F2菌株在高氏一號培養基上培養觀察，菌落在該培養基表面生長緊密，菌落顏色隨著時間的推移逐漸變深 ，即由白色最終變為灰黑色菌落（圖1）；在PDA上培養觀察，可見其產生明顯的黃色色素（圖2）；在ISP4上生長良好，菌落表面由白色變為黑色（圖3）。F2菌株在顯微鏡下觀察，氣生菌絲和基內菌絲均很豐富，氣生菌絲體形成孢子鏈（圖4）。

圖1 F2菌株的菌落形態特征（高氏合成一號培養基）Fig.1 Colony morphology of strain F2(Gause’s Synthetic Agar Mediu)

圖2 F2菌株的菌落形態特征（PDA）Fig.2 Colony morphology of strain F2（PDA）

圖3 F2菌株的菌落形態特征（ISP4）Fig.3 Colony morphology of strain F2（ISP4）

圖4 F2菌株顯微鏡（400X）觀察照片Fig.4 Strain F2 microscope(400X) observation photograph

2.2.2 16S rDNA PCR擴增

PCR 擴增結果顯示，放線菌株 F2 16S rDNA擴增產物大小在 1500 bp 左右 (圖 5)。

圖5 F2 16S rDNA PCR 產物電泳圖Fig.5 16S rDNA PCR product electrophoresis images of F2

結合形態學特征、培養特征和分子生物學鑒定特征分析，并參照《鏈霉菌鑒定手冊》[11]，F2菌株具有典型的鏈霉菌屬的特征，氣生菌絲和基內菌絲均很豐富，氣生菌絲體形成孢子鏈，因此將其初步鑒定為鏈霉菌屬。

3 討論

分離篩選生防菌、研制生防制劑等是當前防治植物病蟲害的一種安全、有效的途徑。近年來，分離篩選拮抗放線菌的研究較多，但尚未發現從茶園土壤這一特定的生態環境中篩選拮抗放線菌的報道。作者前期從茶園中分離并篩選到拮抗放線菌，且對茶白星病等病原菌進行了拮抗性篩選試驗，具有較好的效果。本研究進一步對茶炭疽病進行篩選試驗，其拮抗效果明顯。并對具有顯著拮抗效果放線菌株F2進行了初步鑒定。這些研究結果為該菌株抗菌活性物質的分離純化、結構鑒定和拮抗機理的研究奠定了堅實的基礎。該菌株的抗菌效果好，具有較強開發潛力，在植病生防方面具有良好的應用前景。因此，有必要進一步擴大對其抗菌譜研究，增強其生防應用價值；對其發酵液中抗菌活性物質進行分離純化、結構鑒定，并通過盆缽小區試驗、田間試驗檢驗其生防效果；對其抗菌機理及最佳發酵條件進行深入研究，進一步開發為生物農藥。

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[11]中國科學院微生物研究所放線菌分類組編著.鏈霉菌鑒定手冊.北京：科學出版社,1975.