豬巴氏桿菌病診斷技術行業標準修訂

李偉杰 ， 張 媛 ， 李 建 ， 魏財文 ， 蔣玉文

(中國獸醫藥品監察所 ， 北京 海淀 100081)

1 修訂豬巴氏桿菌病診斷技術的必要性

豬巴氏桿菌病，又稱豬肺疫，是危害我國養豬業的重要疫病之一，我國將之定為二類動物疫病。豬巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)引起的一種以敗血癥和炎性出血為特征的豬傳染病。病原主要存在于病豬肺臟病灶及豬的上呼吸道與消化道中，隨分泌物及排泄物排出體外，健康豬如接觸病豬的排泄物被污染物時，經消化道和呼吸道傳染，即可感染發病。當帶菌豬由于受冷、感冒、饑餓、飼養管理不善、營養不良和寄生蟲感染等，使抵抗力降低時，可促使豬發病。大小豬均有易染性，小豬和中豬發病率較高。一年四季都可發生，特別是春秋兩季更易發生，此病多發生于其他傳染病之后。也可呈地方流行性發生。每年我國生產約1.5億頭份各類豬巴氏桿菌病相關疫苗，盡管如此，各地仍有發病。

用特異性莢膜抗原吸附于紅細胞上作被動血凝試驗，可將多殺性巴氏桿菌分為A、B、D、E和F 5種血清群；利用菌體抗原作凝集試驗，將本菌分為16個血清型。特異性莢膜抗原用大寫英文字母表示，菌體抗原用阿拉伯數字表示，將菌體型和莢膜型兩者結合起來表示，如5：A，6： B，2：D等。我國對本菌血清學鑒定表明，只有A、B和D 3個血清群，沒有E和F血清群。豬以A型及B型為最常見。該病的病型、宿主特異性、致病性、免疫性等，都與血清型有關。

2001年Townsend通過消減雜交確定了多殺性巴氏桿菌種特異性基因kmtⅠ，針對該特異性DNA序列設計引物，所有的多殺性巴氏桿菌都可以擴增出一個460 bp的片段，由此建立了多殺性巴氏桿菌定種的PCR鑒定方法；另外，他對不同莢膜型的多殺性巴氏桿菌的莢膜合成相關基因進行了克隆和分析，多殺性巴氏桿菌莢膜型A、B、D、E、F菌株的生物合成位點的基因分別是hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecJ、fcbD等，針對這幾種莢膜合成基因位點設計引物，擴增出的片段大小分別為1044、760、657、51l bp和851 bp，由此建立了莢膜分型PCR[1]。

行業標準《豬巴氏桿菌病診斷技術》(NY/T 564-2002)于2002年予以實施，其中病原鑒定、血清學試驗等均通過菌株表型特征予以確定，廣大獸醫工作者參照此標準進行豬巴氏桿菌病的診斷[2-5]。近年來，分子生物學技術已經在巴氏桿菌病診斷中得以應用，這些新技術均相比傳統診斷技術更加快速便捷。《豬巴氏桿菌病診斷技術》標準(NY/T564-2002)診斷周期較長，不適于該病的大規模快速診斷。因此，有必要對2002版標準進行修訂，增加上述成熟的快速診斷技術，以便縮短疾病診斷周期，快速作出診斷，對防制起到積極作用。

2 修訂豬巴氏桿菌病診斷技術的依據和基礎

豬巴氏桿菌病診斷技術經過10余年的發展，許多新的技術，特別是分子生物學技術，已經在多殺性巴氏桿菌病診斷中得以應用。PCR方法采用的是設計一對針對基因組某保守基因的引物，進行體外核酸擴增，然后用瓊脂糖凝膠電泳的方法來分離該擴增片段，并進行大小和序列分析。多殺性巴氏桿菌菌種特異性PCR對豬巴氏桿菌病的快速診斷意義重大。多殺性巴氏桿菌種特異性基因kmtⅠ是多殺性巴氏桿菌基因組上一個特有區域，針對本菌該特異性DNA序列設計引物，所有的多殺性巴氏桿菌都可以擴增出一個460 bp的片段。

傳統的多殺性巴氏桿菌莢膜定型技術比較繁瑣，個別菌株由于體外培養莢膜會消失，所以需要先回歸動物，再重新分離細菌制備莢膜抗原進行間接血凝試驗[6]。多殺性巴氏桿菌莢膜型A、B、D、E型菌株和F型菌株的生物合成位點的基因分別是hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD等，它們編碼的莢膜多糖成分已經通過核磁共振檢查研究證實。多殺性巴氏桿菌A型菌株的莢膜多糖成分是透明質酸；B型菌株的莢膜多糖是由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖組成；D型菌株的莢膜物質是一種類似于肝素的多糖。針對這幾種莢膜合成基因位點設計引物，擴增出的片段大小分別為1 044、760、657、51l bp和851 bp，由此建立了莢膜分型PCR。該方法也得到國內研究者的證實[7-9]。

Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2014已將kmtⅠ作為靶基因建立多殺性巴氏桿菌的PCR診斷技術，用于出血性敗血癥的病原鑒定，同時在牛出血性敗血癥和豬萎縮性鼻炎的病原多殺性巴氏桿菌的莢膜定型中應用了多重PCR。本課題組運用建立的多殺性巴氏桿菌定種PCR和莢膜定型多重PCR對60株多殺性巴氏桿菌進行了鑒定，結果與16S rDNA PCR和間接血凝試驗結果的符合率均達100%[10]。以上研究為本標準的修訂提供了理論和技術支持。

3 修訂豬巴氏桿菌病診斷技術的主要工作過程

從中國獸醫微生物菌種保藏管理中心領取63株不同型的致病性豬源多殺性巴氏桿菌，獲得純培養物。采用細菌16S rDNA通用引物對所領取的63株菌的16S rDNA進行擴增，經核酸序列比對確定該63株菌中有60株為多殺性巴氏桿菌。合成多殺性巴氏桿菌種特異性引物及對應于莢膜A、B、D血清型基因的特異性引物，用多殺性巴氏桿菌種特異性PCR方法對已確定為多殺性巴氏桿菌的60株菌進行種鑒定，結果均吻合。制備了多殺性巴氏桿菌莢膜定型血清，用傳統的間接血凝試驗及莢膜定型PCR方法對上述60株豬多殺性巴氏桿菌進行莢膜定型，結果也均一致。結合研究結果，將通過PCR確定多殺性巴氏桿菌種及莢膜血清型的方法優化，規范和制定所有的操作過程和細節，對《豬巴氏桿菌病診斷技術》(NY/T 564-2002)進行修訂，起草修訂草案。委托與本專業相關的11家技術單位對本標準修訂草案進行技術復核并提出修改意見和建議。對征集到的意見及建議進行匯總，根據技術復核單位的復核結果及提出的修改意見對《標準》進行修改完善，形成送審稿。參加全國動物衛生標準化技術委員會組織專家召開的標準審定會，按照專家意見對《標準》再次進行修改完善，形成報批稿。2016年10月26日農業部發布為中華人民共和國農業行業標準(農業部公告第2461號)，自2017年4月1日起實施[11]。

4 修訂豬巴氏桿菌病診斷技術的技術復核

將25株莢膜A型多殺性巴氏桿菌、18株B型多殺性巴氏桿菌、10株D型多殺性巴氏桿菌、1株E型多殺性巴氏桿菌、2株F型多殺性巴氏桿菌及大腸埃希菌、沙門菌、胸膜肺炎放線桿菌、支氣管敗血波氏菌各1株委托農業部獸醫診斷中心、北京市動物疫病預防控制中心、天津市動物疫病預防控制中心、中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所、廣西獸醫研究所、北京市農林科學院畜牧獸醫研究所、山東省農業科學院畜牧獸醫研究所、湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所、青島農業大學動物科技學院、華中農業大學動物醫學院、四川農業大學動物醫學院共11家科研院所采用標準中新增的病原鑒定中的分子生物學鑒定法—定種PCR鑒定方法和莢膜定型的多重PCR鑒定方法進行技術復核，各菌株均至少由2家單位對其進行鑒定。11家單位出具的復核結果表明，定種PCR鑒定方法和莢膜定型的多重PCR鑒定方法均具備良好的特異性及穩定的重復性，可實現豬巴氏桿菌病病原的快速鑒定，滿足豬巴氏桿菌病快速診斷的需求。

5 修訂豬巴氏桿菌病診斷技術的主要內容

“范圍”部分增述了多殺性巴氏桿菌定種的PCR鑒定方法和莢膜定型的多重PCR鑒定方法的適用性。“臨床診斷”及“病理剖檢”部分參照《獸醫傳染病學》(陳溥言主編)[12]中相關描述進行了修改。 “病原分離”部分刪除了不適宜多殺性巴氏桿菌生長的麥康凱瓊脂培養基，并將改良馬丁瓊脂培養基和馬丁肉湯培養基改為更適宜多殺性巴氏桿菌生長的胰蛋白大豆瓊脂培養基和胰蛋白大豆肉湯培養基。新增了定種PCR鑒定方法。“莢膜血清型鑒定”部分在原有的間接血凝試驗( Carter氏莢膜定型法)的基礎上又新增了另一種選擇—多重PCR莢膜定型法，并對多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗程序表也進行了完善。“附錄A”部分增添了胰蛋白大豆瓊脂培養基(TSA)和胰蛋白大豆肉湯培養基(TSB)的制備方法。

6 展望

豬巴氏桿菌病又稱豬肺疫，是由多殺性巴氏桿菌引起的一種以敗血癥和炎性出血為特征的豬傳染病。大小豬均有易染性，小豬和中豬發病率較高。一年四季都可發生，特別是春秋兩季更易發生，此病多發生于其他傳染病之后，也可呈地方流行性發生。最急性型死亡率可達100%，急性型和慢性型死亡率可達60%，造成巨大經濟損失，嚴重危害我國養豬業的發展。

運用新增的多殺性巴氏桿菌定種PCR方法對臨床病例診斷時，與傳統診斷方法相比，可提前7～10天確診，有利于及早對患病豬進行隔離治療，對健康豬群采取預防措施，有效降低患病豬的死亡率和發病率，縮短患病豬的病程和提高治愈率及飼料報酬，從而降低由多殺性巴氏桿菌病造成的經濟損失。 本標準的修訂可實現豬巴氏桿菌病病原的快速鑒定，滿足豬巴氏桿菌病快速診斷的需求，對提高豬群的生產性能有積極作用。

在多殺性巴氏桿菌種的鑒定時，新增的定種PCR方法比傳統的定種方法(如生理生化)更加準確快捷，僅依靠定種PCR結果就可以確診病原，另外該方法較為方便開展該病的大規模流行病學調查。在多殺性巴氏桿菌莢膜定型時，新增的莢膜定型多重PCR方法試驗時間短、操作簡便，不用制備莢膜A型、B型、D型定型血清和被檢多殺性巴氏桿菌莢膜抗原致敏紅細胞，莢膜定型多重PCR試驗所用的試劑均已商品化，易于獲取，減少了檢驗者的人員誤差。從提升診斷技術水平上講，該標準也將發揮積極的促進作用，將分子生物學技術添加進原有標準中，縮短診斷周期，使診斷結果更加準確，有利于臨床獸醫工作者更早做出正確診斷，降低疾病損失。

參考文獻：

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[10] 張媛，魏財文，李建，等. 多重PCR在多殺性巴氏桿菌莢膜定型中的應用[J]. 中國獸醫科學,2014,44(12):1 211-1 216.

[11] NY/T 564-2016. 豬巴氏桿菌病診斷技術[S].

[12] 陳溥言.獸醫傳染病學[M].5版.北京:中國農業出版社,2013.