細胞自噬在結核分枝桿菌感染中的作用

魏凡華 ， 許立華

(寧夏大學農學院 , 寧夏 銀川 750021)

結核病是嚴重危害人類健康的一種感染性疾病，其主要病原體是抗酸性棒狀結核分枝桿菌。1998年世界衛生組織(WHO)的統計結果表明，全世界約有1/3的人口受到結核桿菌的潛在感染[1]。盡管只有一小部分的潛伏感染人口會發展成結核病，這仍然意味著每年將增加800萬結核病例和導致大約150萬結核病人死亡。結核病是死亡率排在第二的傳染性疾病。我國衛生部對結核病的流行病學調查發現，我國結核病的疫情相當嚴峻，并且呈上升趨勢。而且，在新發現的結核病病例中，存在著多重耐藥(Multidrug-resistant，MDR)和廣泛耐藥(Extensively drug-resistant，XDR)現象。

自噬是真核生物中進化保守的對細胞內物質進行周轉的重要過程。該過程中一些損壞的胞質組分或細胞器被雙層膜結構的自噬小泡包裹后，送入溶酶體或液泡中進行降解并得以循環利用。根據細胞物質運送到溶酶體內方式的不同，自噬可分為巨自噬、分子伴侶介導的自噬和小自噬。通常所說的自噬指的是巨自噬，依賴于自噬相關基因(Autophagy-related gene，Atg)的激活。自噬過程可以分為3個階段：(1)啟動階段：自噬小泡膜開始形成，起始階段的關鍵分子是mTOR激酶，可以感受細胞內氨基酸和ATP的數量從而控制細胞的自噬活性；(2)延長階段:自噬小泡膜彎曲、延伸，形成吞噬體膜以包裹吞噬的成分。泛素樣結合系統參與自噬小泡膜的延伸，目前發現有兩個泛素樣結合系統：Apg12/Apg5系統和Apg8及其靶向分子磷脂酰乙醇胺；(3)成熟階段：包括晚期內涵體與溶酶體的融合及自噬體的降解。巨自噬與結核分枝桿菌的感染尤為密切。本文將重點對自噬在抵御結核分枝桿菌感染中的當前研究狀況進行綜述。

1 細胞自噬與抵御病原體感染

多種因素的刺激均可以誘導細胞自噬的發生，例如低氧環境、氧化應激、病原微生物感染和藥物處理。機體可以通過細胞自噬作用降解損傷的細胞器、蛋白沉積物和胞內病原微生物等，從而維持細胞自穩。自噬相關(ATG)蛋白在調節細胞自噬中起著重要的作用，包括自噬的啟動、自噬小體和溶酶體的融合等。常見的ATG蛋白包括：(1))ULK激酶復合物，包括ULK1、ULK2和ATG13等，被AMP激酶(自噬的正調控因子)和 mTOR (雷帕霉素的藥物靶點，自噬的負調控因子)所調控；(2)PI3K復合物，包括VPS34、ATG6 (也稱為Beclin-1)、ATG14 (也稱為Barkor)和VPS15蛋白，參與自噬小體的成核；(3)ATG9，自噬小體形成過程中提供脂質雙層；(4)ATG12-ATG5-ATG16L1復合體；(5)泛素樣微管相關蛋白1輕鏈3 (The ubiquitin-like microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)。ATG12-ATG5-ATG16L1復合體可以發揮E3 連接酶的作用，指導胞質型LC3的C末端與磷脂酰乙醇胺相結合，產生胞膜型LC3-II 形式，形成雙層膜的自噬小體，引發自噬小體與溶酶體的融合，形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物。

自噬是細胞阻斷病原體利用宿主細胞而生長繁殖的手段，是宿主細胞抵御病原體感染的重要機制。宿主細胞可以通過自噬抵御多種病原微生物的感染，包括細菌、真菌、原生動物和病毒等。宿主細胞的大分子或細胞膜被泛素或半乳凝集素所標記，進而被自噬接頭蛋白所識別，例如P62、NBR1、泛素化自噬受體蛋白OPTN或CALCOCO2(Calcium binding and coiled-coil domain 2，CALCOCO2)等，最后在溶酶體中被降解。然而，部分細菌通過分泌效應分子調控自噬信號通路，逃脫自噬介導的降解[2]。

2 細胞自噬與抵御結核分枝桿菌感染

2.1 細胞自噬與結核分枝桿菌感染存在遺傳相關性 研究發現，細胞自噬與結核分枝桿菌感染之間存在著遺傳學上的相關性。全基因組關聯研究(Genome-wide association study，GWAS)表明炎性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)和結核病之間存在著易感基因的遺傳重疊。最先研究認為，ATG16L1和IRGM基因多態性和IBD的發生發展密切相關。進一步研究發現，IRGM基因多態性和結核分枝桿菌感染存在基因關聯性。IRGM基因可以刺激已感染巨噬細胞中吞噬小體的成熟和細胞自噬，誘導結核分枝桿菌的清除。IRGM基因缺失的情況下，小鼠不能有效地清除體內的結核分枝桿菌[3]。在不存在25-羥膽鈣化(甾)醇的條件下，維生素D受體的基因多態性和結核分枝桿菌感染的易感性存在遺傳關聯[4]。此外，TLR2基因多態性也是結核病發生發展的易感位點，TLR2激活后可以通過活化p38信號通路而誘導細胞自噬。

2.2 細胞自噬與天然免疫信號通路 細胞自噬是天然免疫應答的一個重要組成部分，但其活化的信號通路還不十分清楚[5]。已有研究表明，模式識別受體可以激活自噬的發生，通過TRAF6激活或穩定Beclin-1 和ULK1的水平[6]，誘導宿主天然免疫應答，克服結核分枝桿菌感染導致的吞噬小體成熟的靜止。TLR2、TLR4和TLR9在識別結核分枝桿菌，刺激產生抗結核分枝桿菌的效應分子和細胞因子，以及誘導吞噬小體成熟、激活細胞自噬和殺滅病原菌中發揮重要的作用[7-8]。最近研究證實，TLR7也參與抗結核分枝桿菌感染，上調TLR7能夠增加被感染細胞的存活和上調LC3-II的水平[9]。而且，TLR信號通路的一些其他關鍵分子也參與調節了細胞自噬的激活，例如MyD88、β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF)和MAPK激酶。研究發現，結核分枝桿菌的部分編碼分子可以調控細胞自噬。結核分枝桿菌19 KDa的脂蛋白可以通過TLR2通路激活單核細胞和巨噬細胞中的自噬反應。EIS抗原蛋白可以介導細胞和NADPH氧化酶源的ROS生成[10]，上調IL-10水平和激活Akt/mTOR/p70S6K通路[11]，從而抑制宿主細胞自噬的發生。EIS蛋白還具有N-乙酰基轉移酶的作用，可以引發雙特異性磷酸酶DUSP16(Dual-specificity protein phosphatase 16，DUSP16)/MAPK磷酸酶7(MKP-7)55位Lys的乙酰化反應，由于DUSP16/MKP-7是JNK特異的磷酸化酶，因此抑制了JNK的磷酸化和炎性因子的產生[12]。此外，模式識別受體NOD2 可以通過受體相互作用絲蘇氨酸激酶2(Receptor interacting protein kinase 2 ，RIPK2)和ULK1的激活，激活宿主細胞自噬[13]。結核分枝桿菌胞壁酰二肽可以作為NOD2的配基，通過RIPK-2、ATG5、ATG7和ATG16L1，形成吞噬小體[14]。肺泡巨噬細胞中NOD2的激活，誘導IRGM、LC3和ATG16L1基因的表達，促進宿主細胞自噬的發生，有助于下調結核分枝桿菌的毒力。體內動物實驗結果表明，NOD2基因缺失小鼠在受到結核分枝桿菌MDP刺激后，NF-κB激活和IL-1β水平明顯上調[15]，不能有效地募集ATG16L1蛋白和誘發宿主細胞自噬，這說明NOD2介導的自噬通路有助于殺滅病原菌和維持宿主免疫自穩。此外，胞內病原體DNA刺激產生的環化二核苷酸GMP-AMP(cGAMP)和細菌分泌的環鳥苷二磷酸(Cyclic-di-GMP 和Cyclic-di-AMP)也可以誘導宿主細胞自噬和ULK1激活[16]。抑制主要組織相容性復合體(MHC)的抗原遞呈，也是結核分枝桿菌免疫逃避的重要機制[17]。由此可見，對于結核分枝桿菌的相關配基以及抗原蛋白調節宿主細胞自噬的認識，有助于研發用于控制和預防結核病的治療藥物和疫苗。

2.3 細胞自噬與細胞因子 誘導產生細胞因子是宿主抵御結核分枝桿菌感染的重要機制。研究已經證實，部分保護性細胞因子可以激活宿主細胞自噬，促進抗結核分枝桿菌免疫應答。Th1型細胞因子IFN-γ在激活自噬介導的結核分枝桿菌清除中發揮重要的作用，而Th2 型細胞因子IL-4和IL-13可以抑制IFN-γ依賴的自噬激活[18]。IL-4和 IL-13抑制IFN-γ介導細胞自噬的信號通路依賴于STAT6，而抑制饑餓誘導細胞自噬的信號通路依賴于Akt信號。IFN-γ增強了宿主細胞通過自噬反應對結核分枝桿菌的清除，這和誘導產生誘導型一氧化氮合成酶2、干擾素誘導的GTPase 家族LRG47等抗菌效應分子以及上調MHC II分子有關。TNF-α可以促進IFN-γ介導的抗菌應答和自噬反應[19]。其他一些細胞因子，例如IL-17，上調MAPK1/3信號通路，正調控宿主細胞的自噬反應[20]。

細胞因子的產生和自噬反應的激活是相互調控的，細胞因子可以調控自噬反應，同樣地細胞自噬也可以調控細胞因子的水平。例如，細胞自噬可以上調TNF-α的表達和產生，下調部分細胞因子的轉錄、加工和分泌，包括IL-1α、IL-1β、I型干擾素和IL-18。自噬反應下調IL-1β的水平與促進pro-IL-1β降解和抑制AIM2 和 NLRP3炎性小體激活有關[21-22]。宿主細胞自噬反應防止了缺陷線粒體的積累，減少了ROS的產生和線粒體DNA(mtDNA)的釋放。ROS可以激活NLRP3，mtDNA則激活AIM2，從而上調IL-1β的加工和分泌。IL-1α和IL-1β都有助于機體抵御結核分枝桿菌的感染，但是過度的IL-1α產生將會導致炎癥和病理損害，例如Th17功能紊亂和肺部組織壞死[23]。

2.4 宿主細胞通過自噬反應抵御結核分枝桿菌的機制 宿主細胞通過自噬反應殺滅胞內結核分枝桿菌的機制與自噬溶酶體獨特的降解作用和抗菌特性有關，這種降解作用和抗菌特性遠強于普通的吞噬體。細胞自噬可以促進吞噬小體的進一步成熟，克服由于結核分枝桿菌感染導致的吞噬小體成熟受阻。吞噬小體也可以直接捕獲一部分胞內結核分枝桿菌，發展成為具有降解功能的自噬溶酶體[24]。細胞自噬也可以促進抗結核分枝桿菌多肽(例如組織蛋白酶抑制劑等)和溶酶體的融合。此外，細胞自噬促進結核分枝桿菌蛋白的泛素化和靶向溶酶體的輸送[25]，生成和輸送新生抗菌肽[21, 26]。結核分枝桿菌感染轉基因小鼠的體內試驗表明，自噬反應可以有效保護機體病原菌感染、炎癥應答、肺組織病理學和死亡率。Atg5fl/flLysM-Cre轉基因小鼠髓系細胞中缺乏自噬相關基因，結核分枝桿菌Erdman株感染后，Atg5fl/flLysM-Cre轉基因小鼠的細菌負載量和死亡率明顯增加[24]。總之，生理學和免疫學因素刺激觸發的細胞自噬激活均可以殺滅胞內感染的結核分枝桿菌。

3 細胞自噬與結核病治療

不難看出，細胞自噬在抗結核分枝桿菌的宿主免疫應答中發揮重要的作用。結核分枝桿菌毒力蛋白通過阻斷，自噬小體與溶酶體的融合，促進結核分枝桿菌的體內生長[27]。因此，細胞自噬的誘導劑有用于治療結核病的潛力。已有研究表明，硝唑尼特可以有效抑制雷帕霉素靶蛋白的復合體1(Mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1)信號通路和強烈地誘導自噬反應[28]。硝唑尼特的良好治療效果可能與直接殺滅復制和非復制的結核分枝桿菌，以及誘導吞噬細胞的自噬反應有關。采用5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR)處理結核分枝桿菌感染的巨噬細胞，能夠強烈地激活自噬反應，有效地抑制胞內病原菌的生長[29]。這依賴于AMPK誘導的mTOR抑制和AMPK誘導的過氧化物酶體增殖激活受體γ共激活因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α，PPARGC1A)上調，從而導致轉錄因子CEBPB調控的自噬相關基因表達增加和自噬反應激活[29]。激活細胞自噬的免疫佐劑也可能用于結核病的治療。IFN-γ可以激活細胞自噬，輸送結核分枝桿菌到溶酶體。乳酸菌通過上調IFN-γ以及下調IL-4和IL-13，增強了單核吞噬細胞的體外殺菌能力[30]。此外，其他一些激活細胞自噬的藥物也有用于治療結核病的潛力，例如，作用于三磷酸肌醇通路的藥物；抑制HMG-CoA還原酶的藥物；RAC1-mTOR通路的抑制藥物；包括結核分枝桿菌基因的DNA疫苗等。

4 展望

細胞自噬是宿主細胞自主進行的天然免疫防御機制，在抵御胞內結核分枝桿菌感染中具有重要的作用。在結核分枝桿菌感染中，免疫應答與細胞自噬存在著信號通路的交聯，細胞因子與細胞自噬也存在著相互調控，因此，進一步解析細胞自噬通路在宿主抗結核分枝桿菌免疫應答中作用，對以自噬通路為靶標來預防和治療結核分枝桿菌感染將具有深遠的意義。

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