預防豬流行性腹瀉返飼技術的研究進展

廖少山，湯德元，曾智勇，王 彬，黃 濤，胡玲玲，龍冬梅，葉 麗，楊 偉，石元菊，郭倩妤，劉巧玲（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

PEDV是單股正鏈RNA冠狀病毒，核酸具有感染性，基因組長27000～33000個核苷酸，已測定的PEDV的CV777毒株完整基因組大小為28 033bp[1]。PEDV對外界環境耐受力很差，喜歡低溫、高濕環境，可在低溫和高濕環境中長期存活，但是干燥糞便中的PEDV在37℃條件下4 d內死亡[2]。一般的消毒劑對其均有效果，氯仿和乙醚效果最佳。該病最近幾年在全世界迅速流行，中國、東南亞國家、日本、韓國、美國、墨西哥、加拿大流行特別嚴重，對養豬業造成的損失特別嚴重，且有趨勢愈發嚴重。是繼“豬高致病性藍耳病”后，對我國的養豬業又一迎頭重擊，在我國許多豬場，防控PED是重中之重的工作。對該病目前還沒有可行的治療之法，有時發病治療后病情會稍有好轉，但極易反復，復發后病勢更不可控[3]，可能是加快PEDV的變異而危及整個豬場，甚至導致出現地方性流行。雖有商品性PED滅活疫苗或弱毒疫苗，但由于疫苗質量、流行毒株變異、免疫程序影響、產生抗體速度慢等諸多因素導致PED防控效果并不理想。目前，PED暴發后，豬場普遍采取母豬返飼進行應急處理，2013年北美暴發PED疫情后，美國專家力薦返飼，取得了顯著效果[4]。現在我國不少豬場在出現PED疫情后也采用相同的防控措施，效果明顯。但是，縱觀我國養豬行業，大多數的技術人員對于返飼技術不掌握，當PED暴發時，大多數豬場不敢進行返飼或不能科學地進行返飼防控，只是采取抗菌消炎等方法進行保守性綜合治療，徒勞無功，效果甚微。返飼其實一種古老的、傳統的人工自然免疫方法，返飼就是將含有活病原菌的病料給豬定期喂食，促使豬體受到輕微感染刺激而又不表現出致病，在感染刺激下豬體內慢慢地產生抗體而起到免疫該病的作用[5]，對母豬返飼是讓妊娠母豬產生免疫（類似于接種口服弱毒苗），從而使新生仔豬通過哺乳獲得母源抗體，能抵抗病毒感染的過程[6]。簡義虎等[7]設計試驗，研究返飼母豬血清中IgG、IgA抗體水平和對母豬體外排毒情況進行檢測，結果表明：母豬在返飼后第11 d豬血清中IgG抗體明顯上升，并在第20 d IgA與IgG檢測值均達至最高，返飼后第2 d開始向外排毒，在第15 d唾液與糞便均未檢測到PEDV。證明在母豬產前15～30 d返飼效果最好，病毒感染仔豬的概率最低，為臨床防控該病提供理論依據。羅鵬等[8]設計試驗，用PED滅活疫苗和弱毒疫苗對待產母豬進行免疫，與同類母豬進行返飼形成對照，檢測兩組母豬產生抗體的速度和水平，試驗結果表明：采取母豬返飼比接種滅活疫苗免疫產生抗體更快，效果更好，而疫苗免疫雖然能起到一些作用，但是抗體產生速度太慢，小豬得不到及時保護，很難及時控制住PED對豬場造成的損失。齊海濤等[9]試驗表明：返飼能有效地控制冠狀病毒、輪狀病毒的感染，只要使用科學返飼技術進行返飼管理，從實踐來看，科學對母豬返飼是可以有效地控制PED的。

1 人工母豬返飼簡述

在PED的暴發時，束手無策的豬場通常會使用妊娠母豬返飼來防控該病，減少經濟損失。返飼其實是一種古老的傳統的人工主動免疫方法，返飼就是當突發某種疫病而又無可行的治療方法情況下，將含有活病原菌的病料給豬定期喂食或適量肌肉注射，促使豬體受到輕微感染刺激而又不表現致病，感染刺激下豬體內慢慢地產生抗體而起到免疫該病的作用，母豬返飼是用上述方法，先讓妊娠母豬產前產生免疫（類似于接種口服弱毒苗），從而使新生仔豬通過哺乳獲得母源抗體，可抵抗病毒感染而起到自我保護的過程。

其人工母豬返飼原理可簡單表述如下：（提取活病原體）腸道感染病毒－（病毒感染）病毒在腸道復制－黏膜識別免疫刺激－淋巴遷移、乳腺淋巴細胞和免疫刺激－乳汁中抗體增加－對哺乳仔豬產生保護力[10]。

2 返飼樣品的制備

選擇7日齡之內發病第2 d的活仔豬(最好出現腹瀉之前有嘔吐癥狀的仔豬)進行撲殺，因為發病初期哺乳活仔豬腸道中PEDV含量遠遠高于母豬和死亡仔豬腸道中的PEDV含量，2～5日齡仔豬，在開始出現癥狀至18 h內，其腸道收集到的病毒含量和其毒力是最高的，（在臨床觀察和實驗室檢測中發現）因為初生仔豬小腸的絨毛比較長，其上邊具有更多數量的成熟的小腸上皮細胞，這些上皮細胞非常有利于PEDV的繁殖。然后放血，并對體表進行清潔、消毒，剖開腹部，暴露出腹部腸管，在十二指腸與空腸的交界處和空腸與回盲交界處用縫線雙結扎，用手術剪剪下雙結扎點之間的小腸，連同小腸內容物一并收集，含毒量相對較高的其他內臟也可適量收集，存放于病料袋中，置低溫無菌暗光下單獨保存并記錄仔豬的耳號。保存的同時，取少量病料迅速進行PEDV鑒定，經檢測為PEDV為陽性，并排除可能含有其他烈性病原體，如豬藍耳病、豬偽狂犬病和豬瘟等病毒。確定病料安全有效后，把所有返飼病料剪成碎塊，放入5 ℃等量牛奶中或PBS液中，用組織勻漿機制成勻漿，經100目篩過濾。在勻漿中加入適量抗生素如慶大霉素3 mL、新霉素1 g、硫酸黏菌素2 g/100 g組織，對勻漿稀釋 (如8 mL鮮牛奶或PBS液/g組織)。有條件時，可配合熒光定量PCR[11]測定返飼病料中病毒的拷貝數，返飼病料及時置低溫（4 ℃）、陰暗條件下保存，如不當天使用而需要保存于-40℃的冰柜中備用。

3 人工返飼步驟

3.1 在母豬妊娠階段合理營養

日糧中可以適量加入適量的低分子脂肪酸，可提高初乳中蛋白質、免疫球蛋白和不飽和脂肪酸等營養、免疫物質含量，從而增強仔豬抵御病原體特別是腸道病原體的能力，減少哺乳仔豬的腸道疾病[12]。返飼前1周開始在飼料中添加抗生素、多維和葡萄糖，飲水中清除細菌和球蟲，增加返飼母豬的體質。對懷孕后期的母豬飼料中添加腸肽2000 g+綠益態1000 g/t。連續飼喂7～10 d，可促進母豬的泌乳功能[13]。

3.2 每頭返飼用量10 mL上述制備液

但具體用量可以根據實際情況，調至效果最佳劑量，病料拌入飼料或飲水中一次性投喂，整個豬場最好全場同1 d投喂完。返飼后母豬出現輕微腹瀉癥狀，則效果最好，母豬一般2～3 d后會自然恢復，若豬群以前發生過腹瀉并做過返飼，出現癥狀的豬數量在10%左右，若近期免疫過相關疫苗，出現上述癥狀的返飼豬數達到50%以上，如果種豬群沒有免疫過相應疫苗，則以80%以上豬出現癥狀視為返飼成功，否則要進行再次返飼。

3.3 效果檢測

有條件的豬場可以在返飼前后采取血清和糞便做ELISA（酶聯免疫吸附試驗）進行檢測[14]，用ELISA方法既可以檢測抗原也可以檢測抗體水平來判斷返飼的效果。

4 人工返飼的應用現狀

2013年北美暴發PED疫情后，開始也是束手無策，損失慘重，無奈之下美國專家們力薦返飼，采取母豬返飼措施后損失減少，取得了顯著效果。2014年Matthew B等[15]在美國進行調查分析表明，當PEDV在全陰性豬場暴發PED后愿意立即開始或繼續對母豬PEDV返飼馴化的占84%，對主動返飼的688家豬場進行返飼效果統計，結果顯示有604家豬場返飼效果明顯，占88%，84家豬場返飼效果不明顯，占12%。國內返飼成功的案例也多有報導，2013年陳桂華等[16]對邵陽某規模化豬場實施返飼防控，返飼后2～5 d母豬出現嘔吐和輕微腹瀉癥狀，第5 d后病情逐漸好轉，未見到母豬流產等其他不適反應，經返飼后母豬共產下259窩仔豬，仔豬未出現嘔吐、水樣腹瀉等癥狀，則表明該豬場PED得到有效控制，表明通過返飼母豬及配合其他相應的飼養管理措施預防PED具有較好的效果。2014陳志林等[17]在某大型豬場發生PED期間實施返飼母豬，通過結果分析表明采取返飼母豬措施后效果顯著，大大地降低初生仔豬在PED暴發時的腹瀉率和死亡率。齊海濤等試驗表明返飼也能有效地控制冠狀病毒、輪狀病毒的感染。2017年四川某規模化養豬場發生腹瀉疫情，開始病情難以控制，后來采取以返飼母豬為主要措施的綜合防控方案，方案執行1個月后疫情得到有效控制，發病率由原來的90%以上降低到10%以下[18]。

5 母豬返飼的利弊

5.1 返飼的優點

病料是自家豬場的病豬，取材方便、低廉，如不采集病料，對于豬場內病、死豬也要及時進行無害化處理，也是“廢物利用”，同時也是清除病源控制疫病擴散的好辦法，一舉三得。其方法可操作性強，簡單易學，容易上手，會操作人群廣泛，一般的專業技術人員皆可操作，需要設備與器材簡單，一般只需要可調高速組織搗碎機（家用絞肉機也可）、冰箱、電子秤（精確到0．1 g）、手術刀、剪刀、涼的生理鹽水、新鮮牛奶或PBS液、一次性手套、攪拌棒、樣品袋、消毒桶、消毒劑、工作服、膠鞋等，大部分都是豬場常備的，所需要的藥品只有適量的抗生素。當發病毒株的毒力強、病毒滴度高，免疫原性好，產生抗體速度快，母豬返飼效果好。母豬可在返飼2周后產生抗體，而且抗體在母豬體內的消退速度慢[19]，返飼后機體產生抗體的速度要快于疫苗免疫，豬在返飼后第11 d豬血清中IgG抗體明顯上升，并在第20 d IgA與IgG檢測值均達至最高，這樣就可對即將（兩周后）產仔的母豬進行返飼，對仔豬起到免疫保護作用；但是疫苗免疫產生抗體速度沒有這么快，很難實現及時免疫。返飼病料是取自家豬場病豬，病原體是來自于自己豬場所發之病，刺激母豬產生的抗體就是抗該病原體抗體，對本豬場病原體針對強，特異性好，能在較短時間內終止疫病流行降低損失[20]，就算該豬場此次發病病原體是變異毒株，此法也能起到免疫效果，但是疫苗免疫就不可能做到，疫苗免疫面對毒株變異時不但沒有效果，反而會適得其反，導致病情加重。

5.2 返飼的缺點

如果返飼的病料是變異強毒株，沒有經滅活或馴化等生物安全性處理，很可能使強毒株蔓延到整個豬場，而且還有可能導致強毒株地方流行，存在暴發疫病或散毒的風險；同時返飼病料中可能帶有其他病原體，如豬藍耳病毒、偽狂犬病毒等強毒，這樣的返飼反而成了散毒；返飼只針對PED，對其他病原體引起的腹瀉并沒有效果。而且母豬返飼僅適用于哺乳仔豬發生PED之際，沒有發生此疫情時不得提前進行返飼預防；對2周內待產的妊娠母豬和哺乳期母豬也不能進行返飼，因為無法做到確保初乳中含有母源性抗體，及時使仔豬產生免疫力，而且還有排毒的隱患。返飼病料若病毒劑量不夠或病毒滴度不高，不能夠使母豬產生足夠的病毒抗體，易造成返飼無效或導致機體復發感染。返飼病料中含有大量的其他抗原，如異己蛋白抗原，會使其母豬機體受到強制免疫應激，母豬抵抗能力下降而感染其他疾病，同時，過度的免疫刺激，還有可能導致懷孕母豬流產、產弱胎與死胎，后備母豬不發情。初發PED的仔豬中所取得的病料，利用剛出生還未吃初乳的仔豬感染發病進行病毒擴增成本高、速度慢，現在的豬場規模化程度越來越高，母豬數量巨大，難以滿足整個豬場母豬需要的返飼病料量，常因沒有足夠的病料很難實現全場同時免疫。此法只能作為應急措施，也未能先知先用、防范于未然，只能在減少豬場損失上發揮作用，不可能做到零損失。如果返飼的母豬，可能已經感染其他病原體，經過返飼，很可能導致母豬復合感染，或者原有的感染加重或加速呈現病癥。

5.3 返飼過程及注意事項

病料加工處理過程中使用過的器皿和廢棄病料，要及時進行消毒或銷毀處理。病料的加工、返飼、無害化處理都應由專人負責，每次進出加工區域要經過嚴格消毒，其他無關人員不得進入病料加工區域；返飼后12 d內專業技術人員不得換崗或替換。配懷舍母豬不能進產房，但產房斷奶母豬隨時可以進配懷舍；返飼后2 d內配懷舍不作消毒，發病豬前2 d可不作治療，這種方法可能會導致少量母豬流產，尤其是配種后1月的母豬，所以切勿盲目加大返飼劑量。在2周內待產母豬和哺乳期母豬不得進行返飼；對每頭母豬盡量做到返飼一次性成功，不宜反復長時間返飼。母豬返飼是在豬場發生PEDV野毒感染時預防新生仔豬發生腹瀉的常用應急措施，而不能適用于緊急免疫；要做到仔豬吃上初乳，有的仔豬吃不到母乳或哺乳不足時，必須采取人工喂養。返飼后注意消毒處理，母豬的腹瀉糞便必須進行無害化處理，可用生石灰進行掩蓋并及時運出圈舍統一處理，對整個豬場大環境也要進行消毒，防止豬圈內傳播，可用挑戰的金盾消毒劑，按照1： 300與水混合后，使用消毒車對豬舍進行大規模的噴灑消毒，每天早晚各噴灑消毒一次，并及時采取圈舍隔離措施，防止病毒擴散。PEDV對光照和溫度都不穩定，病毒脫離動物后會很快死亡，其抗原性發生改變而削弱了返飼效果，加工好的病料若不能立即使用，必須置低溫（4 ℃）、陰暗條件下保存[21]。在返飼后，對于出現腹瀉的母豬，要利用抗生素預防細菌感染以及添加電解質多維及時補水和防止酸中毒[22]；若有采食量下降的現象，需要添加魚肝油、維生素及電解質等營養物質對腹瀉康復的母豬進行增膘，防止返飼母豬偏瘦[23]；若返飼后的部分待配母豬出現發情推遲，可在飼料中添加葡萄糖等營養物質，促其發情，對發情狀態難以恢復的母豬可做推期配種。

綜上所述，當前PED在我國并沒有消滅，各地呈偶爾散發態勢，隨時可能卷土重來，PED仍是豬場面臨的巨大挑戰。很多養豬人會發現，即使已精心做好流行性腹瀉疫苗的免疫接種，豬場依然會有PED發生，且疫苗的價格不菲，有時花了錢也沒有得到期望的結果。因此如何做好豬場PED的防控需要更多的養殖人員及科研工作者以科學的態度對待PED的防控，當PED來臨時，要根據臨床癥狀、實驗室診斷，然后通過母豬返飼，利用自家毒株去引誘豬體產生抗體，仔豬通過哺乳獲得母源性抗體來提升仔豬抗病能力，起到控制疫情的效果。但是返飼又是一把鋒利的雙刃劍，當豬場發生腹瀉時要冷靜、科學分析，確定引起仔豬腹瀉的病原為PEDV，并排除不含有其他烈性病原體感染后再進行返飼，嚴格按照科學的方法進行返飼，認真操作，及時監控疫情，病情無法控制時要以大局為重，可以選擇性撲殺，尸體無害化處理來控制疫情擴散[24]。盡管返飼技術存有缺陷，而且應用上有一定的限制，但在目前尚無有效控制PED措施的現實情況下，不能否認其積極的作用。PED疫病發生后，對于束手無策的豬場，考慮通過母豬返飼的措施來進行防控，無疑是首選的方案，應當及時采取人工母豬返飼；專業技術人員認真按照科學的返飼技術步驟對母豬進行人工返飼，仔細排查返飼注意事項，返飼技術的缺點是可以克服的。在今后的研究、工作中還需多加總結、科學分析，力求完善返飼技術，穩定返飼效果。