補腎清肝中藥配伍對間歇性低氧誘導人臍靜脈內皮細胞損傷模型p38MAPK/NF—κB信號通路的干預效應研究

鄔春曉+張京春+劉玥+馬林沁+喬羽+雷舒雁+鄭喬仙

[摘要] 研究補腎清肝中藥配伍對間歇性低氧致人臍靜脈內皮細胞損傷模型p38MAPK/NF-κB信號通路的干預效應。實驗采用改良的間歇性低氧誘導人臍靜脈內皮細胞建立體外細胞損傷模型，以補腎清肝中藥有效成分配伍（異鉤藤堿、桃葉珊瑚苷及川芎嗪）作為干預藥物，首先進行中藥最優配伍濃度體外篩選，然后選擇最優配伍濃度作為干預劑量，觀察其對模型p38MAPK/NF-κB信號通路的干預效應。結果顯示異鉤藤堿、桃葉珊瑚苷及川芎嗪在0.01 mg·L-1時具有最佳的體外抗炎效應。間歇性低氧組NF-κB p65入核量及p-IκB較對照組與其他各組均顯著增加，同時免疫熒光染色NF-κB p65可見間歇性低氧組出現明顯NF-κB p65核移位表現，內皮細胞黏附程度明顯增加；與間歇性低氧組相比，p38MAPK抑制劑組及補腎清肝中藥配伍組 p-p38MAPK，NF-κB p65入核量及p-IκB表達量均明顯較少，內皮細胞黏附明顯被抑制。該研究表明，補腎清肝中藥最優濃度配伍通過將抑制p38MAPK的磷酸化作為起始，繼而阻斷了NF-κB的核移位行為，抑制其轉錄功能，實現對間歇性低氧誘導血管內皮細胞損傷模型的保護效應。

[關鍵詞] 間歇性低氧； 人臍靜脈內皮細胞； 中藥； p38MAPK； NF-κB

[Abstract] This study aims to explore the intervention effect of Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver on intermittent hypoxia（IH） induced injury model of HUVECs through p38MAPK/NF-κB signaling pathway in vitro. HUVECs injury model was induced by modified IH treatment. The effective components of Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver including isochteroside， aucubin and ligustrazine were used as intervention drugs. The optimal compatibility concentration of them was screened in vitro， and then the optimal compatibility concentration was selected as the intervention dose to observe the effect on p38MAPK/NF-κB signaling pathway in IH induced injury model of HUVECs. The results showed that isochnae， aucubin and ligustrazine had the best anti-inflammatory effect at concentration of 0.01 mg·L-1. NF-κB p65 and p-IκB in the nucleus in IH group were significantly higher than those in the normal control（N） group and the other groups. Immunofluorescence staining showed significant translocation of NF-κB p65 nucleus in IH group， and HUVECs adhesion capacity in IH group was increased significantly. As compared with IH group， the expression levels of p-p38MAPK， NF-κB p65 and p-IκB in p38MAPK inhibitor（INH） group and Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver（GDC） group were significantly decreased， and HUVECs adhesion capacity in INH group and GDC group was significantly inhibited as well. The optimal concentration of Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver can inhibit the phosphorylation of p38MAPK， and then inhibit the nuclear translocation and transcription function of NF-κB. This may be the mechanism of the protective effect of Chinese medicine on IH induced injury model of HUVECs.

[Key words] intermittent hypoxia； HUVECs； Chinese medicine； p38MAPK； NF-κB

《中國心血管病報告2016》指出，高血壓是心腦血管疾病的重要危險因素之一，50%～75%的腦卒中和40%～50%的心肌梗死發生均與血壓升高相關。阻塞型睡眠呼吸暫停綜合征（OSAS）是獨立于年齡、肥胖、吸煙等引起高血壓的重要危險因素。OSAS患者睡眠中頻繁發生的呼吸暫停，使機體處于間歇性低氧（intermittent hypoxia，IH）和再氧合交替出現的特殊內環境。IH不同于持續低氧的特點是存在低氧后的正常氧的插入，較持續低氧使更易于造成血管內皮功能的損傷，是OSAS致高血壓靶器官損傷的重要機制之一[1]。中醫藥對高血壓在調節機體整體平衡、控制血壓水平穩定及防治靶器官損害等方面具有獨特優勢。作者在前期臨床實驗中，深入探索高血壓病的中醫病機與證治規律，發現補腎清肝中藥配伍治療輕中度高血壓具有保護血管內皮功能、調控血壓變異性等靶器官保護效應[2]，但具體作用機制尚不明確。本研究通過間歇性低氧誘導人臍靜脈內皮損傷建立體外模型，觀察補腎清肝中藥配伍對該模型p38MAPK/NF-κB信號通路的干預效應，以期為中藥對OSAS相關心血管疾病的防治提供實驗證據。endprint

1 材料與方法

1.1 藥物 中藥鉤藤的有效成分異鉤藤堿（批號111927-201403）、中藥杜仲的有效成分桃葉珊瑚苷（批號111761-200601）、中藥川芎的有效成分川芎嗪（批號110817-201307）均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 細胞來源 人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）由健康產婦、正常分娩12 h內臍帶的臍靜脈分離提取（臍帶由中日友好醫院婦產科提供）。

1.3 HUVECs的分離及培養 無菌條件下取健康產婦、正常分娩12 h內臍帶20～30 cm，PBS沖洗臍帶并去除兩端，鑷子擴張靜脈腔，插入三通管并固定。三通管另一端連接針頭后插入倒置的PBS瓶中，抽推進器使PBS流入針筒，關閉此開關閥后推推進器使PBS流入臍帶，注意防止氣泡。以上操作清洗臍帶2～3次直至無肉眼可見血色。臍帶末端插入帶有膠皮管的針頭，重復清洗1次后，將連接三通管針頭插入0.1%膠原酶溶液瓶中，倒置酶瓶后抽推進器使酶液流入針管，關閉此開關閥后推推進器直至酶液充滿整條臍帶。臍帶置入37 ℃水浴15 min后回收消化液，PBS清洗后重復回收2次，收集消化液，加入預先室溫放置的ECM（20%FBS）5 mL，灌洗、離心（1 000 r·min-1，5 min）收集細胞，制成細胞懸液按1×106～1.5×106個/mL接種于10 mL培養皿中，置于37 ℃，5%CO2條件下培養。細胞90%以上單層融合狀態時用0.25%胰蛋白酶消化、傳代培養至4～7代用于以下實驗。

1.4 間歇性低氧致HUVECs損傷模型的復制 模型復制方法參考文獻進行改進[3]。使用低氧裝置Modular Incubator Chamber（MIC-101）（美國 Billups-rothenberg）建立間歇性低氧誘導內皮損傷細胞模型。將細胞培養皿放入低氧裝置中（預先紫外照射消毒），暴露時以低氧（1%O2，4%CO2，96%N2）氣流洗脫細胞培養艙中的氣體，監測直至氧氣濃度達到5%后停止。繼而維持低氧狀態5 min（即IH時段），再以正常氧（21%O2）氣流洗脫低氧氣體，而后再維持10 min（即再氧合時段），周而復始形成循環2，4，6，8次逐級遞增至16次。

1.5 分組與干預方法 正常對照組（N）：將培養基換為無血清ECM，培養箱中常規培養4 h。間歇性低氧模型組（IH）：將培養基換為無血清ECM，置于低氧裝置內，低氧/復氧循環16次（4 h）。補腎清肝中藥配伍組（GDC 1，0.1，0.01，0.001）：將異鉤藤堿、桃葉珊瑚苷、川芎嗪均按1，0.1，0.01，0.001 mg·L-1加入到無血清ECM中，替換原培養基，低氧/復氧循環16次（4 h）。p38MAPK抑制劑組（INH）： 將培養基換為無血清ECM，p38MAPK阻斷劑SB203580 5 mg·L-1預處理30 min，此后置于低氧裝置內，低氧/復氧循環16次（4 h）。

1.6 檢測指標及方法 炎癥因子檢測：實時熒光定量PCR（QPCR）技術測定HUVECs上清液中IL-1，IL-6，ICAM-1，E-selectin及TNF-α的含量。p38MAPK/NF-κB通路相關蛋白的檢測：采用Western blot的方法檢測各組間p-p38MAPK表達量的變化。分離細胞胞漿、胞核蛋白后檢測NF-κB通路炎癥相關蛋白胞漿、胞核中表達量差異。HUVECs細胞間黏附能力檢測：熒光探針標記THP-1細胞，加入處理后HUVEC 細胞37 ℃共孵育30 min，熒光顯微鏡下拍照比較黏附密度。

1.7 統計方法 數據采用SPSS 20.0統計軟件分析處理，實驗數據均采用±s表示，組間比較采用t檢驗，2組以上比較采用One-way ANOVA，檢驗顯著性水平定為P<0.05。

2 結果

2.1 補腎清肝中藥配伍最佳干預劑量的篩選 為探討補腎清肝中藥配伍的體外對炎癥因子的干預效應，同時進行其最佳干預劑量的篩選，分別設立了異鉤藤堿、桃葉珊瑚苷及川芎嗪1，0.1，0.01，0.001 mg·L-14個質量濃度梯度進行篩選。結果顯示補腎清肝中藥配伍在0.01 mg·L-1（GDC）這個劑量濃度時炎癥因子的表達IL-1，IL-6，TNF-α明顯低于其余各干預組（P<0.05），見圖1。因此選定0.01 mg·L-1作為最佳干預劑量進行后續實驗。

2.2 補腎清肝中藥配伍最佳干預劑量對p38MAPK/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，IH組中NF-κB p65入核量、p-IκB較對照組與其他組均顯著增加，NF-κB通路明顯被激活。IκB，p-p65，IKK-β等無明顯變化，見圖2。同時免疫熒光染色NF-κB p65，Confocal鏡下可見IH組出現明顯NF-κB p65核移位表現。藍色標記的HUVECs細胞核內出現綠色熒光標記的NF-κB p65。入核后的NF-κB p65亮度明顯高于胞漿中表達的NF-κB p65，見圖2。INH組、GDC組 p-p38MAPK，NF-κB p65入核量、p-IκB表達量與IH比較明顯較少，說明補腎清肝中藥配伍及p38MAPK阻斷劑SB203580可通過抑制IH后p38MAPK的磷酸化阻斷其下游NF-κB信號通路。

2.3 補腎清肝中藥配伍最佳干預劑量對間歇性低氧誘導HUVECs損傷過程中 THP-1 細胞黏附的影響 熒光顯微鏡下觀察，正常對照（N）組（128.2±6.72）可見少量 THP-1細胞黏附；IH組（231.2± 8.43）可見明顯增加THP-1 細胞黏附；GDC組（134.8±8.67）可見明顯抑制THP-1細胞黏附于HUVEC；INH組（122.4±7.12）可見明顯抑制THP-1細胞黏附于HUVEC，見圖3。

3 討論endprint

在建立穩定的間歇性低氧誘導人臍靜脈內皮細胞損傷模型基礎上，觀察了不同濃度的補腎清肝中藥配伍的干預效應，發現異鉤藤堿、桃葉珊瑚苷、川芎嗪在0.01 mg·L-1這個劑量時具有最佳的抑制炎癥因子的效應，并不具有劑量依賴性。

大量研究報道補腎清肝中藥配伍的各有效組分（異鉤藤堿、桃葉珊瑚苷、川芎嗪）具有廣泛的心血管系統藥理作用。桃葉珊瑚苷是中藥杜仲的主要活性成分，具有明顯的抗炎活性，能夠抑制NF-κB的p65亞基由細胞胞漿內向核內的移位，并通過阻止IκB的磷酸化和降解，使胞漿內IκB濃度升高，進而抑制NF-κB活性從而下調TNF-α和IL-6的合成與表達[4]。對于桃葉珊瑚苷及桃葉珊瑚苷苷元抗炎活性的進一步研究表明，真正發揮作用的分子可能是桃葉珊瑚苷水解產物桃葉珊瑚苷苷元，桃葉珊瑚苷苷元通過抑制細胞中NF-κB活性進一步抑制TNF-α的生成[5-6]，與本研究結果一致。異鉤藤堿是茜草科植物鉤藤的主要有效成分，具有降壓及抗炎作用。有學者研究發現靜脈注射異鉤藤堿可降低未開胸犬的平均動脈壓；同時能夠調控NO的產生，降低磷酸化細胞外信號調節激酶蛋白和p38MAPK，抑制炎癥反應，起到保護血管、降低血壓的作用[7-8]。研究表明川芎嗪可通過改善氧化應激，降低炎性因子水平，拮抗Ca離子內流，調控一氧化氮水平，抑制血管內皮炎癥性損傷等實現降壓作用[9-11]。為進一步探討補腎清肝中藥配伍血管內皮保護機制，從體外角度觀察了中藥干預后模型NF-κB通路蛋白表達量的變化，結果發現，與模型組比較，補腎清肝中藥配伍最優劑量組p-p38MAPK，p-IκB的表達明顯被抑制；同時采用免疫熒光標記NF-κB p65，觀察到補腎清肝中藥配伍干預后的NF-κB p65入核量明顯減少。

綜上所述，補腎清肝中藥配伍將抑制p38MAPK的磷酸化作為起始，阻斷NF-κB的核移位，抑制其轉錄功能，最終實現其對間歇性低氧誘導血管內皮細胞損傷模型的保護效應。

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[責任編輯 張寧寧]endprint