口腔速溶膜劑中他達拉非的反相高效液相色譜測定

趙宗良+高瑩+曹青日

[摘要]目的 建立反相高效液相色譜（RP-HPLC）分析方法測定口腔速溶膜劑中他達拉非（TDF）的含量。方法 用溶劑澆鑄法制備每2 cm×3 cm理論含藥量為20 mg的他達拉非口腔速溶膜劑。采用色譜柱：Cosmosil 5 C18-MS-Ⅱ（4.6×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液（44：56）為流動相，檢測波長：285 nm，流速：1.0 ml/min，柱溫40℃，進樣量20 μl，測定他達拉非口腔速溶膜劑中的藥物含量。結果 他達拉非在0.8～40 μg/ml的濃度范圍內線性關系良好（R2=0.9998）；日內精密度相對標準偏差RSD為0.002%～0.963%，日間精密度RSD為1.22%～1.83%，平均加樣回收率為99.22%，定量限為0.902 ng，檢測限為0.271 ng。他達拉非口腔速溶膜劑中的藥物含量為96.43%。結論 建立的他達拉非RP-HPLC分析方法專屬性強，精密度、回收率高，穩定性良好，適用于他達拉非口腔速溶膜劑中藥物的含量測定。

[關鍵詞]反相高效液相色譜；他達拉非；口腔速溶膜劑；聚乙烯醇；含量測定

[中圖分類號] R698.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）12（a）-0008-04

[Abstract]Objective To establish ananalytical method of reverse phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC） to analyze the Tadalafil （TDF） content in Orodispersible Films （ODFs）.Methods TDF-loaded ODFs with a loading capacity up to 20 mg TDF in an area of 2 cm×3 cm were prepared using a solvent casting method.The chromatographic column was Cosmosil 5 C18-MS-Ⅱ （4.6×250 mm，5 μm） and mobile phase of acetonitrile-0.1% Trifluoroacetic Acid （44：56） were used，the detection wavelength was set at 285 nm，the flow rate was 1.0 ml/min，the column temperature was maintained at 40℃ and the injection volume was 20 μl.The drug content in TDF-loaded ODFs was analyzed.Results The TDF concentration range with good linear relationship was 0.8-40 μg/ml，R2=0.9998.The RSD of intra-day was in the range of 0.002%-0.968%，RSD of inter-day was in the range of 1.22%-1.83%.Mean result of recovery rate was 99.22%.The limit of quantitation （LOQ） was 0.902 ng and the limit of detection （LOD） was 0.271 ng.The drug content of TDF-loaded ODFs was 96.43%.Conclusion The RP-HPLC method of TDF showed high specific，good precision，recovery rate and stability.This method is suitable for thedetermination of drug content of TDF-loaded ODFs.

[Key words]RP-HPLC；Tadalafil；Orodispersible films；Polyvinyl alcohol；Content determination

口腔速溶膜劑（Orodispersible Films，ODFs）是一種口服速釋膜劑，供口含、舌下給藥和口腔內局部貼敷，經唾液潤濕并黏附在給藥部位，膜溶解或分散同時釋放藥物的一種膜制劑[1-2]。ODFS優點：無需飲水，使用方便，迅速起效，無卡喉危險，兒童或老年患者可方便服用，患者順應性得到提高[3]。他達拉非（Tadalafil，TDF），商品名：西力士（Cialis），主治男性勃起功能障礙（ED），其能夠顯著改善男性勃起功能減退和早泄癥狀[4-5]。2003年TDF經FDA批準在美國上市，2004年12月登錄中國。迄今為止，臨床上應用的是TDF片劑，一般在性活動前半小時服用[6]。該口服片劑具有溶散時限長、溶出度低、藥效慢的特點，此外，無水時患者不能或者很難服用片劑，且吞咽困難的患者不能服用[7]。而口腔速溶膜劑恰好彌補以上缺點，同時可提高藥物的生物利用度[8-9]，服用后經唾液溶解分散，藥物起效快，提高患者的服藥順應性，所以開發TDF口腔速溶膜劑意義重大。本研究以聚乙烯醇1788為成膜材料，聚乙二醇400為增塑劑，海藻酸鈉為崩解劑，十二烷基硫酸鈉為表面活性劑，水為溶劑，采用溶劑澆注法制備TDF口腔速溶膜劑，并深入探討建立利用反相高效液相色譜（RP-HPLC）測定其含量的方法，現報道如下。

1儀器與試藥

1.1儀器

島津LC2010A高效液相色譜儀；JA2003N電子天平（上海精密儀器有限公司）；MS1/MS2迷你振蕩器（廣州儀科實驗室技術有限公司）；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；H-1650臺式高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）。endprint

1.2試藥

他達拉非（批號：20150409，蘇州大學自制）；乙腈為色譜純，購自西格瑪奧德里奇；低粘度聚乙烯醇1788（PVA 1788）、聚乙二醇400（PEG 400）為化學純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；海藻酸鈉（ALG-Na）、十二烷基硫酸鈉（SDS）為化學純，購自國藥集團化學試劑有限公司；水為超純水（產自實驗室純水儀）；其他試劑為分析純。

2方法與結果

2.1膜劑的制備

將135 mg PVA 1788加入4 ml純化水中，放置在70℃水浴中充分攪拌溶解，完全溶解后依次加入33.8 mg PEG 400、13.5 mg ALG-Na和8 mg SDS，維持70℃水浴持續攪拌至成澄清溶液，超聲除去氣泡。加入過120目篩的100 mg TDF，磁力攪拌均勻后超聲。所得制劑均勻涂布在不銹鋼板（10 cm×3 cm）上，隨后水平放置在60℃電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥2 h后拿出，自然冷卻后將形成的膜從不銹鋼板上剝離，切割成2 cm×3 cm/片的TDF口腔速溶膜劑。

2.2色譜條件

色譜柱：Cosmosil 5 C18-MS-Ⅱ（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液（44∶56），檢測波長：285 nm，流速：1.0 ml/min，柱溫：40℃，進樣量：20 μl。

2.3溶液制備

空白制劑溶液：按“2.1”項下制備不含TDF處方的空白膜劑，取1片（2×3 cm2）置于50 ml容量瓶中，加10%總體積的0.1%三氟乙酸溶散，加50%總體積的乙腈溶解，用0.1%三氟乙酸定容后混勻，精密吸取1 ml置于50 ml容量瓶中，用乙腈/0.1%三氟乙酸（1：1）定容后混勻即得。

對照品溶液：精密稱取20 mg TDF至50 ml容量瓶中，加50%的乙腈溶解，用0.1%三氟乙酸定容后混勻，精密吸取1 ml置于50 ml容量瓶中，用乙腈/0.1%三氟乙酸（1：1）定容后混勻即得。

供試品溶液：取1片（20 mg）TDF的ODFs置于50 ml容量瓶中，按空白制劑溶液制備方法制備即得。

2.4專屬性考察

取“2.3”項下制備的空白制劑、對照品和供試品溶液，離心，按“2.2”色譜條件測定，考察專屬性。結果表明，該色譜條件下，無雜質干擾測定，峰形好，柱效較高，方法專屬性強（圖1）。

2.5線性關系考察

精密稱取50 mg的TDF至50 ml容量瓶中，加25 ml乙腈將藥物溶解，用0.1%三氟乙酸定容后混勻，得TDF儲備液，用乙腈/0.1%三氟乙酸（1：1）稀釋成0.8、1.6、8、20、40 μg/ml的標準溶液。離心后，按“2.2”色譜條件測定。以峰面積（A）為縱坐標，質量濃度（C）為橫坐標繪制標準曲線（圖2），得到回歸方程：A=19 021.1642C-179.9919，R2=0.9998。結果表明，TDF溶液在0.8～40 μg/ml范圍內成良好線性關系。

2.6精密度考察

精密稱取20 mg TDF至50 ml容量瓶中，按“2.3”項下對照品溶液制備方法，制備低深度（0.8 μg/ml）、中濃度（8.0 μg/ml）和高濃度（40.0 μg/ml）的三種標準溶液，在0、2、4、6、8 h測定，計算各濃度水平峰面積（A）的相對標準偏差（RSD），得日內精密度（表1）；連續5 d測定各濃度標準溶液，計算5 d中各濃度水平峰面積（A）的RSD，得日間精密度[10]（表2）。結果表明，方法的精密度良好。

2.7加樣回收率考察

按“2.6”項下的方法制備低、中和高濃度的標準溶液，每個濃度各5份，過濾后按“2.2”項下色譜條件測定，計算回收率（表3）。結果表明，含量測定方法的回收率高。

2.8定量限和檢測限考察

取“2.3”項下的對照品溶液，用乙腈/0.1%三氟乙酸（1：1）逐步稀釋至主峰的響應值約為噪音水平的10倍（圖3），得TDF定量限為0.902 ng；響應值約為噪音水平的3倍（圖4），得TDF的檢測限為0.271 ng。

2.9穩定性考察

取“2.6”項下制備的低、中和高濃度的TDF標準溶液，室溫下放置0、2、4、6、8、24 h后取樣，離心后按“2.2”項下色譜條件進樣，外標法計算濃度，得出TDF標準溶液3個濃度的RSD分別為1.00%、0.40%和0.79%（表4）。結果表明，0.8～40 μg/ml范圍內，TDF溶液室溫下24 h內是穩定的。

2.10含量測定

取2×3 cm2 TDF的ODFs，按“2.3”項下制備方法制備供試品溶液，離心后按“2.2”項下色譜條件測定。外標法計算含量為96.43%（n=3，RSD為0.84%）。

3討論

TDF是新一代PDE5抑制劑，相對西地那非和優地那非，它有更長半衰期（17.5 h），長達36 h的治療時間窗，患者服藥更靈活，能從容、自然地進行性生活，更大程度上獲得生理、心理滿足[11-12]。臨床研究表明，TDF對各種病因和各種程度ED患者的勃起功能有有效的改善，包括難治性ED，如重度脊髓損傷后、糖尿病性及前列腺切除術后ED等[13-14]。

文獻資料表明，采用HPLC方法，可有效檢測TDF原料藥及片劑中的主藥含量[15-20]。但迄今為止，未見到TDF口腔速溶膜劑含量測定相關文獻報道。本研究建立TDF的RP-HPLC分析方法學，線性回歸方程：A=19 021.164 2C-179.991 9，R2=0.9998，日內精密度在0.002%～0.963%之間，日間精密度在1.22%～1.83%之間，平均回收率為99.22%，測定膜劑中TDF含量為96.43%。本研究所建立的分析方法專屬性強，精密度、回收率高，穩定性良好，可用于TDF口腔速溶膜劑中藥物含量測定。endprint

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（收稿日期：2017-10-19 本文編輯：孟慶卿）endprint