鄰苯二甲酸二異癸酯對小鼠學習記憶的影響

路 雨,李 瑤,胡贏丹,李秋林,趙 云,鄒 鑒,劉瀟童,楊 旭,李 睿 (華中師范大學生命科學學院,遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430079)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)是一種人工合成的有機化合物,可以作為增塑劑添加到塑料制品中以增加其可塑性、柔韌性和延展性,因此被大量生產并廣泛應用于工業和制造業中[1].研究表明,傳統增塑劑鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)可對實驗動物的腦、腎臟、肺臟、肝臟等多種器官造成損傷[2-3],從而被以鄰苯二甲酸二異癸酯(DIDP)為首的一些新型增塑劑逐漸取代.目前,DIDP已經在全球范圍內得到廣泛應用,主要用于聚氯乙烯(PVC)薄膜、食品包裝材料、家具地板等建筑材料和醫療用品中[4].塑料中的 DIDP釋放后,擴散至空氣、土壤和水體中,造成環境富集[5].DIDP可通過口腔攝入、氣道吸入、皮膚暴露、醫療注射等途徑進入人體.由于兒童極易將PVC材質的玩具放入口中,所以其經口腔攝入 DIDP的風險相對較大[6].流行病學調查顯示,PAEs暴露與兒童和塑料行業工人的過敏癥高發率之間存在一定聯系[7],而Shen等發現DIDP的長期暴露可使小鼠形成獲得性過敏性體質并加重過敏原誘導的過敏性皮炎[8].

DIDP可對健康造成一定危害,且其在全球范圍內應用廣泛,因此相關的毒理學研究非常重要.歐盟在對于 DIDP的風險評估報告中指出,DIDP在生殖方面無明顯毒性,但是對小鼠后代存在不利影響[9].此外,研究表明,DIDP可使小鼠肝腎器官出現明顯腫大,同時高濃度 DIDP暴露可促進小鼠肝細胞腺瘤的增殖[10].對于傳統增塑劑 DEHP、鄰苯二甲酸丁基芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)等物質的研究表明,此類物質可對小鼠大腦產生損傷,影響其學習記憶能力[11-12].然而,目前有關新型增塑劑 DIDP神經毒性的研究相對較少,特別是其對大腦功能的影響更是鮮有報道.為此,本研究通過對不同濃度DIDP暴露下的小鼠進行 Morris水迷宮實驗,測定 DIDP對小鼠學習和記憶的影響以及白藜蘆醇(Res)對機體的保護作用,并通過測量受試小鼠腦組織中氧化應激和炎癥因子指標,以期深入探索DIDP的神經毒性以及氧化應激在DIDP致小鼠神經毒性中的作用.

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究選用5～6周齡SPF級雄性昆明小鼠,體重(26±2)g,購自湖北省實驗動物中心.動物飼養于華中師范大學實驗動物中心.每天光照 12h,黑暗12h,給予充足的水和食物.

1.2 試劑與儀器

試 劑 ：DIDP(Sigma,純 度 ＞99%),吐 溫 -80(Amresco),Res(Sigma,純度＞97%),8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)酶聯免疫吸附試劑盒(Bluegene),腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素 1β(IL-1β)酶聯免疫吸附試劑盒(eBioscience)、微量還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒(南京建成),2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(Sigma,純度＞97%),硫代巴比妥酸(TBA,上海試劑二廠),其他試劑均為國產分析純.

儀器：低溫冷凍離心機(Eppendorf-5415R),三用電熱恒溫水箱,FL×800熒光酶標儀(Bio-Tek,全波長酶標儀(DNM-9602).

1.3 實驗方法

將42只雄性昆明小鼠隨機分成6組,每組7只,分別標記為 A：生理鹽水組;B：1.5mg/(kg?d)D IDP 組;C：15mg/(kg?d) DIDP 組;D：150mg/(kg?d)DIDP 組;E：Res 組;F：150mg/(kg?d)DIDP+Res 組.用生理鹽水將DIDP與吐溫80以體積比1：1配制成 15mg/mL的染毒母液,使用時按照比例用生理鹽水稀釋成 0.15,1.5mg/mL的染毒液進行染毒.每天每只小鼠的DIDP灌胃量(mL)與小鼠體重(g)的比值是 1：100,確保最終的染毒劑量.Res：先加入無水乙醇對Res粉末進行促溶,然后加入所需體積的生理鹽水配置成 2mg/mL的Res溶液,確保最終的劑量是 20mg/(kg?d),現用現配;對照組按照同樣比例灌胃生理鹽水.每天清晨進行灌胃,連續染毒 9d,其中 150mg/(kg?d)DIDP+Res組在染毒2h后進行Res灌胃.本實驗全部測試,均重復3次.

1.4 Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮由英國心理學家Morris于上世紀80年代設計而成,主要應用于嚙齒類動物學習和記憶能力的研究,如今在神經生物學領域內得到廣泛應用.本實驗采用的水迷宮如圖1所示,小鼠被放置在一個直徑為1.2m的內壁不反光的不銹鋼圓形水箱中,所處的實驗環境安靜,光線布局合理.其中水池深為 60cm,水溫為(24±1)℃.將圓形水池按照東西南北4個等距點分為4個象限(NW、NE、SE、SW),每個象限的池壁上對應不同的圖形,小鼠可根據圖形識別位置并產生空間記憶.逃逸平臺位于NW象限的正中央距離池壁30cm,淹沒于水下 1cm.實驗時,根據方案選擇恰當的水點,使小鼠面向池壁,將其輕放入水中,讓其自由游泳.水池上方的攝像機將其游泳軌跡、速度以及逃逸時間等記錄并傳入計算機,由smart 3.0軟件記錄并分析[13].

圖1 Morris水迷宮實驗裝置示意Fig.1 Experimental system of Morris water maze

水迷宮實驗主要由定向航行和空間探索兩個實驗組成：定向航行實驗主要用來測試小鼠的學習能力,空間探索實驗主要測試小鼠的記憶能力.前7d的實驗中,小鼠染毒4h后進行游泳訓練.將小鼠分別從NE、SE、SW 3個象限中放入,同時開始記時.每天訓練3次,每次時間為60s.若小鼠在60s內登上逃逸平臺且停留3s,則訓練結束,所花費的時間即為逃逸潛伏期;若小鼠在 60s內并未發現逃逸平臺,則記錄逃逸潛伏期為 60s.然后人工將小鼠放置于逃逸平臺后并計時,持續30s后拿出,目的在于讓小鼠觀察四周,學習并定位平臺所在位置,形成了一定的空間記憶.第 8d為小鼠記憶遺忘期,正常染毒但不進行實驗.1d的遺忘期后,在第 9d進行空間探索實驗,將平臺拆除后按照之前方法進行實驗,小鼠自由游泳60s.通過比較不同組小鼠在逃逸平臺所在象限(NW象限)的停留時間以及游泳軌跡圖進而分析得到小鼠的學習和記憶情況[14].

1.5 腦組織樣品的制備

第10d將小鼠脫頸處死.取腦組織置于冰上,稱量并記重.按10mL/g添加PBS(pH=7.5)并使用勻漿器配制成 10%的腦組織勻漿.腦組織勻漿在4℃、10000rpm的條件下離心15min,收集上清并進行分裝后,置于-80℃冰箱內冷凍保存.

1.6 腦組織海馬體病理學檢測

將小鼠腦組織取出后,用 4%的多聚甲醛進行固定過夜.常規脫水,石蠟包埋,取小鼠腦組織中海馬體進行H&E染色.顯微鏡觀察、拍照.

1.7 8-OHdG和炎癥因子TNF-α、IL-1β的檢測

采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA) 檢測腦組織勻漿中 8-OHdG含量以及炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量,按照說明書中具體步驟進行操作.

1.8 氧化應激水平的測定

ROS測定：采用DCF熒光法[15].用PBS緩沖液先將 10mmol/L的 DCFH-DA 熒光染料稀釋1000倍,然后將腦組織勻漿液稀釋25倍.取稀釋后染料和組織勻漿各 100μL混勻,在 37℃下孵育10min后,測量其在480nm激發光,520nm發射光下的熒光強度.MDA含量測定：采用TBA法[16].取5mL試管,加入0.5mL待測腦組織勻漿.各管加入2mL0.6%TBA溶液,混勻后放置于沸水浴中15min,冷卻.用離心機在 10000r/min條件下離心10min,取上清液.分別在450,532,600nm波長下測定吸光值,按照公式：濃度=[6.45(OD532-OD600)-0.56OD450]/prot計算樣品中MDA的濃度.GSH含量測定：使用GSH試劑盒來檢測腦組織中GSH的含量,具體步驟按照說明書進行操作.

1.9 統計學分析

使用Origin 6.0軟件作圖,SPSS 17.0軟件分析數據.水迷宮定向航行實驗數據采用重復測量的方差分析,隨后采用Tukey test做兩兩比較.其他數據采用單因素方差分析,隨后采用Tukey test做兩兩比較.將P＜0.05定為顯著水平.

2 結果

2.1 體重變化及腦組織臟體比

如圖 2A所示,小鼠每天自由進食和飲水,體重逐漸增加.與對照組相比,DIDP暴露組小鼠體重并未顯著增加(P＞0.05).如圖2B所示,DIDP暴露組小鼠腦組織臟體比隨著染毒濃度的增加而減小,與對照組相比,無統計學意義(P＞0.05).

圖2 各組小鼠體重變化及腦組織臟體比Fig.2 Weight changes and Brain organ-body ratios of mice in different groups

2.2 小鼠Morris水迷宮實驗結果

如圖 3A、3B所示,與對照組相比,150mg/(kg?d)DIDP組小鼠平均逃逸時間顯著增加(P＜0.05).與 150mg/(kg?d) DIDP 組相比,150mg/(kg?d) DIDP+Res組小鼠平均逃逸時間減少,有顯著性差異(P＜0.05).

圖3 小鼠水迷宮實驗結果Fig.3 The water maze test results of mice

圖3C表示在第9d空間探索實驗中,小鼠在原平臺所在象限(即 NW 象限)停留時間.由圖可知,與對照組相比,150mg/(kg?d) DIDP組小鼠的停留時間顯著減少(P＜0.05).與 150mg/(kg?d)DIDP組相比,150mg/(kg?d) DIDP+Res組小鼠停留時間增加,無統計學意義(P＞0.05).

圖3D表示小鼠在第9d空間探索實驗中的游泳路徑,顯示出對照組小鼠游泳路徑集中在原平臺所在象限(即 NW 象限),具有方向性和目的性.而DIDP染毒組小鼠游泳路徑沒有目的性,且缺乏規律性.

2.3 小鼠腦組織中氧化應激指標的檢測

2.3.1 ROS水平 如圖4A所示,DIDP染毒組小鼠腦組織中ROS水平隨染毒劑量的增加而升高.與對照組相比,15,150mg/(kg?d)DIDP組小鼠ROS水平顯著升高(P＜0.05);150mg/(kg?d) DIDP+ Res組小鼠與 150mg/(kg?d) DIDP組相比,ROS水平降低,且有顯著性差異(P＜0.05).

2.3.2 GSH含量 如圖4B所示,DIDP染毒組小鼠腦組織中GSH濃度隨染毒劑量的增加而降低.與對照組相比,15,150mg/(kg?d) DIDP組小鼠GSH 濃 度 顯 著 降 低 (P＜0.05);150mg/(kg?d)DIDP+ Res組小鼠與 150mg/(kg?d) DIDP組相比,GSH濃度升高,有顯著性差異(P＜0.05).

2.3.3 MDA含量 如圖4C所示,DIDP染毒組小鼠腦組織中 MDA濃度隨染毒劑量的增加而升高.與對照組相比,150mg/(kg?d) DIDP組小鼠MDA 濃度極顯著升高(P＜0.01);150mg/(kg?d)DIDP+Res組小鼠與 150mg/(kg?d) DIDP組相比,MDA濃度降低,有極顯著性差異(P＜0.01).

2.3.4 8-OHdG含量 如圖4D所示,DIDP染毒組小鼠腦組織中8-OHdG濃度隨染毒劑量的增加而升高.與對照組相比,150mg/(kg?d) DIDP組小鼠8-OHdG 濃度極顯著升高(P＜0.01); 150mg/(kg?d)DIDP+Res組小鼠與 150mg/(kg?d) DIDP組相比,8-OHdG濃度降低,有顯著性差異(P＜0.05).

圖4 各組小鼠腦組織ROS、GSH、MDA和8-OHdG含量Fig.4 The ROS、GSH、MDA and 8-OHdG content in different groups

2.4 小鼠腦組織中炎癥因子指標的檢測

2.4.1 TNF-α含量 如圖5A所示,DIDP染毒組小鼠腦組織中 TNF-α含量隨染毒劑量的增加而升高.與對照組相比,15,150mg/(kg?d)DIDP組小鼠TNF-α含量極顯著升高(P＜0.01);150mg/(kg?d) DIDP+Res 組小鼠與 150mg/(kg?d)DIDP組相比,TNF-α含量降低,有極顯著性差異(P＜0.01).

2.4.2 IL-1β含量 如圖5B所示,DIDP染毒組小鼠腦組織中 IL-1β含量隨染毒劑量的增加而升高.與對照組相比,15mg/(kg?d)DIDP組小鼠IL-1β含量顯著升高(P＜0.05),150mg/(kg?d) DIDP組小鼠 IL-1β含量極顯著升高(P＜0.01);150mg/(kg?d) DIDP+Res組小鼠與150mg/(kg?d) DIDP組相比,IL-1β含量降低,有極顯著性差異(P＜0.01).

圖5 各組小鼠TNF-α和IL-1β含量Fig.5 The TNF-α and IL-1β content in different Groups

2.5 小鼠大腦海馬區H&E染色切片

如圖6所示,對照組(圖6A)結果顯示小鼠海馬 CA1區錐體細胞分布均勻,細胞整齊排列,細胞形態完整,多數呈多角形,錐體細胞頂狀樹突明顯可見,輪廓清晰.而隨著 DIDP暴露濃度的升高,15,150mg/(kg?d) DIDP 組(圖 6C、圖 6D)小鼠大腦可見損傷,表現為錐體細胞排列松散,混亂,細胞腫脹變圓,頂狀樹突消失.150mg/(kg?d)DIDP+Res組(圖6F)小鼠海馬CA1區存在受損細胞,與 150mg/(kg?d) DIDP組相比,正常細胞數量增多,細胞損傷情況得到一定的緩解.

圖6 各組小鼠腦組織海馬體H&E染色Fig.6 H&E staining of hippocampus in brain tissue in different groups

3 討論

3.1 DIDP的濃度設置

DIDP的日攝入耐受量(TDI)值為 0.25mg/kg/d[16].在這個限制的基礎上,考慮到人與嚙齒動物之間耐藥性的差異,故設置小鼠每日灌胃濃度為：0,1.5,15,150mg/(kg?d) DIDP.

3.2 DIDP對小鼠學習記憶能力的影響

Morris水迷宮實驗可以系統全面地考察實驗動物空間認知加工的過程,通過定向航行和空間探索實驗觀察實驗動物的學習與記憶能力,客觀地反映其認知水平.海馬是腦內同空間記憶密切相關的結構.劉鋒明等研究表明BBP染毒的小鼠海馬組織受到損傷,學習記憶能力明顯下降[11].本研究表明,150mg/(kg?d) DIDP組小鼠在前 7d的定向航行實驗中,平均逃逸時間顯著增加,而在第9d的空間探索實驗中,其在原平臺所在象限停留時間縮短,游泳路徑大多無目的性且不規則.病理學檢測結果表明,15,150mg/(kg?d) DIDP組小鼠的海馬組織受到損傷.這與Tang等研究結果是一致的[12].因此,DIDP暴露導致的小鼠學習記憶能力下降可能與其引起的海馬組織受損有關.

3.3 DIDP的氧化損傷作用

生物細胞的新陳代謝能夠產生ROS.正常情況下,細胞內的ROS會被胞內抗氧化酶等還原性物質清除,使體內自由基的產生與消除處于平衡狀態.若機體受到刺激發生氧化損傷,細胞可能會產生過量的ROS,通過氧化應激進一步造成細胞和組織不同程度的損傷[17].過量的ROS會引發脂質過氧化作用,MDA是脂質過氧化作用最終的分解產物[19].ROS過量還會引發 DNA損傷,而8-OHdG是目前公認的 DNA損傷的生物標志物

[20].GSH是體內重要的氧自由基清除劑,過量的 ROS可以消耗機體內 GSH,導致機體抗氧化能力下降[18].本研究中,15,150mg/(kg?d) DIDP 可以使小鼠腦組織 ROS含量升高,而 MDA、8-OHdG含量的升高表明小鼠腦組織中脂質過氧化水平升高,DNA出現一定程度的損傷.同時,因DIDP暴露引起的小鼠腦組織中GSH含量的降低反映出機體抗氧化能力降低.以上生物指標含量的變化表明,DIDP對小鼠腦組織造成了一定程度的氧化應激.Tang等[12]研究表明,腦組織氧化應激水平升高可造成小鼠學習記憶能力的下降.氧化應激可以通過增加炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達量進一步激活炎癥信號通路[21-22].本實驗中, DIDP染毒組小鼠的腦組織中炎癥因子TNF-α 和IL-1β的表達量升高,顯示炎癥反應被激活.而 Ma等研究表明學習記憶能力下降的小鼠,其大腦中炎癥因子表達升高[23].以上結果表明,DIDP致小鼠學習和記憶能力下降可能與其在腦組織中造成的氧化應激和炎癥反應損傷有關.機制可能是 DIDP及其主要代謝產物對大腦中海馬組織的神經細胞膜造成了氧化損傷,使神經信號傳導受到影響,進而影響學習和記憶力.

3.4 Res的抗氧化作用

Res是廣泛存在于葡萄、黎蘆、虎杖等植物中的一種多酚類化合物,其重要特點之一是具有良好的抗氧化性[24].Res含有3個酚羥基,在機體中可以競爭性結合自由基,從而減少自由基含量,緩解氧化應激造成的損傷,具有降低血脂、誘導腫瘤細胞凋亡、提高免疫功能、抗氧化等作用[25].楊迎暴等研究顯示,Res對大鼠脊髓損傷脂質過氧化反應和活性氧水平有抑制作用[26].王娜等[27]研究顯示,20mg/(kg?d) Res能明顯改善大鼠高腸源性內毒素血癥,提高腸黏膜的抗氧化作用.故本實驗中,選用 20mg/(kg?d) Res 對 150mg/(kg?d)DIDP組小鼠進行保護.結果顯示,其腦組織中的氧化損傷與 DNA損傷受到抑制,且學習記憶能力的下降也得到顯著緩解,表明可能由于 Res降低了機體自由基含量,并提高了 GSH 的水平,因而降低了氧化應激對機體產生的損傷,從而能夠對 DIDP暴露導致的小鼠腦損傷進行有效保護.也進一步證明,氧化應激在 DIDP致小鼠學習和記憶能力下降的過程中具有重要作用.

4 結論

4.1 15,150mg/(kg?d) DIDP暴露可對小鼠腦組織造成明顯的氧化損傷,并促進炎癥因子 TNF-α和IL-1β的表達.

4.2 Morris水迷宮結果顯示,DIDP能夠對小鼠學習與記憶能力產生一定程度影響,引起小鼠學習和記憶的障礙.其機制可能是 DIDP及其代謝產物通過對小鼠大腦中海馬組織造成氧化損傷,進而影響小鼠的學習記憶能力.

4.3 Res可在一定程度上保護機體,減少由DIDP引起的氧化損傷.

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